李 杰，孟慶玲，喬 軍，伍曄暉，王熙鳳，王立霞，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一種重要的食源性人獸共患病原菌，人類通過食用被LM污染的食物發(fā)生感染，引起孕婦流產(chǎn)，幼兒或免疫能力低下者感染腦膜炎，胃腸炎等嚴(yán)重疾病[1-2]。LM具有強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力，能耐受高溫、酸、堿、滲透壓、乙醇和氧化應(yīng)激等各種脅迫環(huán)境[3]。

生物被膜(Biofilm,BF)是細(xì)菌通過分泌的多糖、蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物粘附于生物或非生物表面形成的膜樣結(jié)構(gòu)[4-5]?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，BF可增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性和環(huán)境應(yīng)激抵抗能力，從而影響細(xì)菌的毒力[6]?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，agr群體感應(yīng)系統(tǒng)參與LM BF的調(diào)控[7]，agr基因座由4個基因組成，其中agrB負(fù)責(zé)膜蛋白的表達(dá)，它與Sps共同作用可將agrD表達(dá)的肽段轉(zhuǎn)化為成熟的自誘導(dǎo)肽(AIP)；agrC和agrA形成一個轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的雙組分系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)胞外AIP濃度達(dá)到一定閾值時，通過群體感應(yīng)激活agrC-agrA系統(tǒng)，被激活的系統(tǒng)調(diào)節(jié)BF形成相關(guān)基因的表達(dá)[8-10]。有研究證實(shí)，agr位點(diǎn)基因突變降低了LM粘附于非生物表面形成BF的能力[11-12]，BF陰性菌株agr基因座表達(dá)水平顯著低于BF陽性菌株[10]。

細(xì)菌BF形成與其AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子密切相關(guān)。AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在許多菌中已被報(bào)道參與細(xì)菌BF的形成[13-14]，然而在LM菌中尚未見報(bào)道。因此，本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建LM-△lmo2672缺失株，分析比較LM EGD-e親本株和LM-△lmo2672缺失株在不同溫度、滲透壓、膽酸鹽、H2O2等環(huán)境中BF生成量的差異，利用qRT-PCR檢測BF相關(guān)基因(agrA，agrB，agrC，agrD)的轉(zhuǎn)錄水平，探討lmo2672基因在LM BF形成中的作用，為進(jìn)一步了解LM AraC家族在調(diào)控BF的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

LM EGD-e菌株由德國伍茲堡大學(xué)W.Goebel教授惠贈；pKSV7由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體，T4連接酶，限制性酶切酶KpnⅠ，PstⅠ，DL 5000 DNA marker，DL 2000 DNA marker購自TaKaRa公司；基因組DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN生化技術(shù)有限公司；氯霉素，膽汁酸鹽購自Sigma公司；BHI培養(yǎng)基青島海博生物科技有限公司，氯化鈉購自天津盛奧生物試劑公司。

1.2 引 物

根據(jù)NCBI中LM EGD-e的基因序列(登錄號：AL591824.1)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)LM缺失株構(gòu)建過程中所涉及的引物及BF相關(guān)基因的qRT-PCR引物，其中R1和R4 5′端分別添加KpnⅠ、PstⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基(斜體下劃線部分)(表1)。

表1 本研究中所用引物Table 1 List of primer sequences used in this study

1.3 LM-△ lmo2672缺失株的構(gòu)建

1.3.1 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-△lmo2672的構(gòu)建 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取LM EGD-e菌株的基因組DNA，用R1/R2和R3/R4兩對引物分別擴(kuò)增出目的片段的上、下游同源臂。以上、下游同源臂為模板，通過SOE-PCR技術(shù)融合上下游同源臂，獲得缺失目的基因的融合片段，將融合片段和pKSV7同時提質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ和PstⅠ雙酶切后用T4連接酶過夜連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-△lmo2672。

1.3.2 LM-△lmo2672缺失株的構(gòu)建與鑒定 將pKSV7-△lmo2672在2.5 kV，5.0 ms條件下電轉(zhuǎn)至LM感受態(tài)中，用R1/R4引物鑒定陽性克隆，并將陽性菌在氯霉素和42 ℃雙重抗性下連續(xù)傳代進(jìn)行同源重組，用旁外側(cè)引物R5/R6引物檢測確定獲得缺失株；將缺失株在無氯霉素抗性， 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20代并檢測其遺傳穩(wěn)定性。

1.4 lmo2672基因缺失對LM在不同環(huán)境中BF形成能力的影響

利用微孔板法制備BF。將過夜培養(yǎng)的LM EGD-e和LM-△lmo2672分別離心收集菌體，用新鮮的BHI培養(yǎng)基調(diào)整OD600至0.2，分別吸取200 μL菌液加入96孔微孔板，放置于不同溫度(4 ℃，30 ℃和37 ℃)；用含5% NaCl、8% NaCl、0.3%膽酸鹽、5 mmol/L H2O2的BHI培養(yǎng)基調(diào)整OD600至0.2，放置于37 ℃培養(yǎng)到指定時間后，棄去培養(yǎng)基并用無菌水洗滌微孔板3次，充分洗凈孔內(nèi)浮游菌體，室溫干燥以去除微孔板中液體；加入結(jié)晶紫染色，用酶標(biāo)儀測定OD570nm以代表BF生成量。每個樣品設(shè)置5個重復(fù)。

1.5 lmo2672缺失對LM BF相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

參考Rieu等[11]設(shè)計(jì)的BF相關(guān)基因qRT-PCR引物。將待測菌液用新鮮的BHI培養(yǎng)基接種于六孔板中，分別放置于4 ℃，30 ℃；或用含5% NaCl、8% NaCl、0.3%膽酸鹽、5 mmol/L H2O2的BHI培養(yǎng)基接種于六孔板中，在37 ℃培養(yǎng)24 h，收集BF狀態(tài)下的細(xì)菌進(jìn)行總RNA提取，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定cDNA質(zhì)量濃度，以統(tǒng)一質(zhì)量濃度的cDNA為模板，以管家基因rpoB和16S rRNA作為內(nèi)參，在LightCycler 480儀器上進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果根據(jù)2-△△CT的方法計(jì)算4對BF相關(guān)基因(agrA，agrB，agrC，agrD)的相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行組間差異顯著性分析，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05(*)被認(rèn)為差異顯著，P<0.01(**)被認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-△ lmo2672構(gòu)建及鑒定

分別擴(kuò)增目的基因上、下游同源臂，可擴(kuò)增出638 bp和698 bp的條帶，經(jīng)SOE-PCR后，得到 1 336 bp的融合片段，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)；將融合片段與pKSV7載體連接，雙酶切后條帶大小與理論相符，表明已成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-△lmo2672(圖2)。

M.DNA maker(DL2000);1-3.上下游臂融合片段 Fusion segments of upstream and downstream regions; 4.陰性對照 Negative control

圖1lmo2672基因上下游臂SOE-PCR擴(kuò)增
Fig.1 Amplification oflmo2672gene by SOE-PCR

M.DNA maker(DL2000 Plus); 1.pKSV7-Δlmo2672雙酶切產(chǎn)物 Products of the pKSV7-Δlmo2672by double enzyme digestion; 2.pKSV7-△lmo2672質(zhì)粒 Recombinant plasmid pKSV7-Δlmo2672; 3.pKSV7空質(zhì)粒 Empty plasmid pKSV7

圖2 pKSV7-△lmo2672雙酶切鑒定
Fig.2 Identification of pKSV7-△lmo2672by double enzyme

2.2 LM-△ lmo2672缺失株的篩選及遺傳穩(wěn)定性的鑒定

利用R5/R6引物篩選能擴(kuò)增出大小為 1 502 bp條帶的重組菌株，獲得LM-△lmo2672缺失株(圖3)；在37 ℃、無氯霉素抗性的培養(yǎng)基中繼續(xù)傳20代，R5/R6引物檢測均可擴(kuò)增出 1 502 bp單一片段(圖4)，表明LM-△lmo2672具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

M.DNA maker(DL2000); 1.陽性對照 Positive control； 2-4.LM-△lmo2672重組菌旁外側(cè)引物檢測結(jié)果 PCR products of the recombinant LM-△lmo2672; 5.陰性對照 Negative control

圖3 旁外側(cè)引物對LM-△lmo2672重組菌的鑒定
Fig.3 Identification of LM-△lmo2672by PCR

2.3 lmo2672缺失對LM在不同環(huán)境中BF生成能力的影響

在37 ℃時，兩株菌所形成的BF沒有顯著差異(P>0.05)；但在4 ℃和30 ℃，LM-△lmo2672BF生成量均顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖5-A)；在5%和8% NaCl中，與LM EGD-e相比，LM-△lmo2672BF生成量顯著減少(P<0.05)(圖5-B)；在5 mmol/L H2O2和 0.3%膽酸鹽中，LM-△lmo2672BF生成量減少，顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖5-C)，表明lmo2672缺失能降低LM在不同環(huán)境中BF的形成量。

M.DNA maker(DL2000);1-2.陽性對照 Positive control;3.陰性對照 Negative control

圖4 LM-△lmo2672缺失株遺傳穩(wěn)定性鑒定
Fig.4 Genetic stability analysis of recombinantstrain of LM-△lmo2672

2.4 lmo2672缺失對LM在不同階段BF形成能力的影響

在培養(yǎng)24 h時，LM-△lmo2672所形成的BF交聯(lián)程度弱于LM EGD-e，但差異不顯著(P>0.05)；在48 h時，LM-△lmo2672生物被膜著色厚度以及形成量極顯著低于LM EGD-e(P<0.01)(圖6)，表明lmo2672基因參與LM BF的形成。

2.5 lmo2672缺失對LM BF相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

在4 ℃和30 ℃，LM-△lmo2672中4個與BF形成相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖7-A、圖7-B)；在高滲透壓環(huán)境中，LM-△lmo2672agrA和agrB基因表達(dá)量顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖7-C、圖7-D)，且隨著滲透壓的升高，LM-△lmo2672BF相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生降低；在氧化環(huán)境中，agrC基因表達(dá)量顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖7-E)；在膽酸鹽環(huán)境中，LM-△lmo2672BF形成相關(guān)基因的表達(dá)量均極顯著低于LM EGD-e(P<0.01)(圖7-F)，表明lmo2672缺失后BF形成相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制。

圖5 LM EGD-e和LM-△ lmo2672在不同脅迫環(huán)境中的BF形成Fig.5 Biofilm formation by LM EGD-e and LM-△ lmo2672 under various conditions

3 討 論

LM是一種重要的食源性致病菌，由于其對各種環(huán)境壓力的強(qiáng)耐受性和BF形成的能力使其在加工設(shè)備表面上殘留并形成BF，因此在動物源性食品生產(chǎn)和加工中極易被污染[15-16]，給動物性食品安全造成較大威脅[17-18]。現(xiàn)有研究認(rèn)為，AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子介導(dǎo)細(xì)菌BF相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[13-14]，在許多細(xì)菌BF形成過程中發(fā)揮重要的調(diào)控，然而關(guān)于LM中AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子lmo2672是否影響LM BF形成目前尚不清楚。

細(xì)菌BF的形成一般分為初始粘附、不可逆粘附、微菌落形成、成熟、播散期5個階段[19]。在非生物表面孵化的24 h之前是細(xì)菌形成BF粘附的重要時期，在48 h后被認(rèn)為是BF形成的成熟期[10,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在37 ℃培養(yǎng)24 h時，LM-△lmo2672缺失株與LM EGD-e 親本株BF形成量差異不顯著；但在48 h時LM-△lmo2672生物被膜生成量以及BF著色程度顯著低于LM EGD-e，提示lmo2672可能在BF成熟期中發(fā)揮作用。

A.在24 h，48 h時LM BF OD570的測定 Biofilm of LM biofilm determined by OD570at 24 h and 48 h,respectively;B.在24 h，48 h時LM顯微鏡下BF結(jié)構(gòu) Formation of biofilm by LM at 24 h and 48 h,respectively.

圖6lmo2672基因缺失對LM在不同時間BF形成的影響
Fig.6 Effects oflmo2672gene deletion at different times on biofilm formation of LM

A-F.分別為4 ℃，30 ℃，5% NaCl，8% NaCl，5 mmol/L H2O2和0.3%膽酸鹽中BF相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測 Relative transcriptional levels of genes related to biofilm formation at 4 ℃,30 ℃,5% NaCl,8% NaCl,5 mmol/L H2O2and 0.3% bile salts,respectively

圖7 LM EGD-e和LM-△lmo2672在不同應(yīng)激環(huán)境中BF相關(guān)基因相對轉(zhuǎn)錄水平的檢測
Fig.7 Relative transcriptional levels of genes related to biofilm formation under differentenvironmental stresses in LM EGD-e and LM-△lmo2672

BF形成受多種因素的影響，其中溫度對BF的形成影響較大[17,21]。Di Bonaventura等[17]分析44株LM分離株在不同溫度下BF形成情況，發(fā)現(xiàn)隨著溫度降低，LM形成的BF組織結(jié)構(gòu)越稀疏；Chavant等[22]研究表明，LM在37 ℃時對聚四氟乙烯表面有定植能力，但在8 ℃時則沒有。本研究證實(shí)，在37 ℃更有利于LM形成BF，而在4 ℃和30 ℃時，LM-△lmo2672生物被膜生成量顯著低于LM EGD-e。qRT-PCR結(jié)果證實(shí)，隨著溫度的降低，LM-△lmo2672生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)量逐漸下降，在4 ℃和37 ℃ 4個基因的表達(dá)量均顯著低于LM EGD-e，表明lmo2672基因缺失后導(dǎo)致LM在低溫下BF的形成能力降低，且BF相關(guān)基因的表達(dá)也受到抑制。

已有研究表明，AraC調(diào)控因子通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)影響表皮葡萄球菌、糞腸球菌等BF的形成[23-24]。本研究利用結(jié)晶紫染色法制備BF，比較LM EGD-e和LM-△lmo2672在高滲透壓、膽酸鹽、H2O2環(huán)境中BF生成量的差異，證實(shí)LM-△lmo2672BF形成量在不同應(yīng)激環(huán)境下均顯著降低，進(jìn)一步qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，lmo2672基因缺失后，LM-△lmo2672agr系統(tǒng)基因表達(dá)量也出現(xiàn)降低，其中在膽汁酸鹽環(huán)境中4個BF相關(guān)基因的表達(dá)量顯著降低，在滲透壓中，agrA和agrB基因表達(dá)量顯著降低，在氧化環(huán)境中，agrC基因表達(dá)量顯著降低，提示lmo2672基因可能通過調(diào)控agr系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)來降低LM BF的形成能力。

總之，本研究證實(shí)LM-△lmo2672缺失株在不同環(huán)境中BF形成量顯著降低，且BF相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，表明AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白lmo2672在LM BF形成過程中發(fā)揮重要作用，為揭示AraC家族調(diào)控因子在LM BF形成能力中的作用提供理論依據(jù)。