上游開放閱讀框uORF廣泛存在于動植物基因的5非翻譯區(qū)，通常能夠抑制下游主開放閱讀框pORF的翻譯。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組率先利用CRISPR/Cas9技術(shù)對uORF進行編輯，發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高目標基因的翻譯效率，建立了利用基因組編輯調(diào)控內(nèi)源基因蛋白質(zhì)翻譯效率的新方法，相關(guān)成果于2018年發(fā)表在Nature Biotechnology;該方法可以培育出不含轉(zhuǎn)基因成分的基因過表達植物，為作物育種及功能基因研究提供了十分重要的技術(shù)手段。由于uORF在動植物基因組中普遍存在，編輯uORF提高內(nèi)源蛋白水平將有廣泛的應(yīng)用。為了進一步普及和促進該方法的使用，高彩霞研究組日前在Nature Protocols發(fā)表文章，詳細介紹對植物基因的uORF進行編輯提高目標基因翻譯效率的具體實驗流程。

真核細胞的mRNA由5非翻譯區(qū)（5 Untranslated Region， 5UTR）、編碼蛋白的開放閱讀框區(qū)（Open Reading Frame）及3端非翻譯區(qū)（3 Untranslated Region， 3UTR）構(gòu)成。上游開放閱讀框（uORF， Upstream Open Reading Frame）是位于cDNA 5前導(dǎo)序列（5 Leader Sequence）的一類元件，在動植物中廣泛存在，可以參與基因翻譯水平的調(diào)控，在很多情況下對基因主開放閱讀框（pORF， Primary Open Reading Frame）的翻譯具有抑制作用。本技術(shù)論文在此基礎(chǔ)上詳細介紹了如何利用基因組編輯技術(shù)修飾基因的uORF，實現(xiàn)調(diào)控目的基因的表達。整個流程包括：植物內(nèi)源基因uORF的預(yù)測;雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證;預(yù)測的uORF對目的基因翻譯水平的影響;設(shè)計并構(gòu)建sgRNA對uORF進行編輯;瞬時實驗中驗證基因組編輯技術(shù)突變的uorfs序列對下游目的基因表達的影響;篩選transgene-free的純合uorf突變體植株并分析脫靶效應(yīng);在mRNA、蛋白和表型水平對野生型、uorf突變體植株中的目的基因表達量測定等具體方法和實驗細節(jié)。其中預(yù)測并在瞬時實驗中確定uORF的功能需要2-3周時間。4個月左右可以獲得目的基因表達水平不同程度增強的uorf突變體。

該文章于2020年1月8日在線發(fā)表于Nature Protocols雜志上（DOI：10.1038/s41596-019-0238-3）。高彩霞研究組博士生司小敏為該論文的第一作者，高彩霞為通訊作者。相關(guān)研究得到科技部、國家自然科學(xué)基金委等的資助。