吉莉莉，陳雪玲，魏艷，付婷婷，何丹，張崟*，趙黎明,2，王衛(wèi)

(1.成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106；2.華東理工大學(xué) 發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心，生物反應(yīng)器工程重點實驗室，上海 200237)

四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸具有獨(dú)特的風(fēng)味，其風(fēng)味形成過程是在濕度、溫度及環(huán)境微生物等綜合因素作用下，通過發(fā)酵產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味[1]。該香腸與國外的發(fā)酵香腸不同，口感上不會偏酸，而且更加醇厚，有回香。在四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸制作過程中，乳酸菌是其風(fēng)味形成的重要菌種[2]。乳酸菌可以利用糖源，發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸等有機(jī)酸，使香腸的pH降低，抑制了其他有害菌的生長，使乳酸菌在產(chǎn)品中具有顯著的優(yōu)勢性[3]。因此，在四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸制品中存在著大量乳酸菌。

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸分子，脫水可縮聚為聚乳酸[4]。聚乳酸是制備生物可降解塑料的重要原料[5]。聚乳酸塑料備受輕工業(yè)界的重視，也是近年來國家重點扶持的新材料種類。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[6,7]、工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[8,9]，以及食品包裝中均有應(yīng)用[10]。如何獲得高效產(chǎn)乳酸分子的乳酸菌，對聚乳酸塑料的工業(yè)制造非常關(guān)鍵。為此，為了獲得高效產(chǎn)乳酸菌種，本文以四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸為原料，對其中的乳酸菌進(jìn)行分離、純化和鑒定，以期為制備生物源乳酸分子提供菌種，并為開發(fā)肉制品發(fā)酵劑及傳統(tǒng)肉制品加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

香腸原料肉、輔料(食鹽、香辛料、醪糟、紅曲米、味精等)：購自成都市十陵鎮(zhèn)鑫大百貨。MRS培養(yǎng)基、甘露醇培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司。GEN Ⅲ 微生物鑒定板、去碳源培養(yǎng)基：美國Biolog公司。Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA Ladder Mix Marker、通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

拍打式無菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；MicroStation微生物鑒定系統(tǒng) 美國Biolog公司；PCR儀 美國Applied Biosystems公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；冷凍高速離心機(jī) 美國BBI公司。

1.3 方法

1.3.1 四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸加工工藝

原料肉→絞肉→混勻(肥肉∶瘦肉為3∶7，加入輔料)→灌腸→冷風(fēng)干燥10 d→真空包裝。

1.3.2 香腸中菌相分析

香腸風(fēng)干10 d后，對樣品中的各種微生物進(jìn)行計數(shù)。在樣品不同部位無菌取樣25 g，剪碎，放入無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水于拍打式均質(zhì)器中拍打5 min，10倍倍比稀釋后，選擇合適的稀釋濃度，在不同的培養(yǎng)基平板中進(jìn)行培養(yǎng)，每個濃度做3個重復(fù)，37 ℃，48 h后進(jìn)行計數(shù)。PDA培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基于25 ℃，120 h后進(jìn)行計數(shù)。

1.3.3 乳酸菌菌株分離純化

觀察記錄MRS培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)，挑取優(yōu)勢菌落單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在MRS平板上劃線純化，直至整個平板和鏡下觀察菌落形態(tài)一致。將已純化的菌株接種斜面于4 ℃，用于平時使用。利用瓷珠保存于-80 ℃，用于長期菌種保存。

1.3.4 菌種的鑒定

1.3.4.1 微生物鑒定系統(tǒng)鑒定

挑取純化的菌落，接種于去碳源平板中，30 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌棉簽挑取已去碳源的菌落于IF培養(yǎng)基中，調(diào)整比濁度至98%左右，將IF培養(yǎng)基接種于GEN Ⅲ 微生物鑒定板中，每孔50 μL，置于30 ℃，培養(yǎng)24 h，在微生物鑒定系統(tǒng)中讀取數(shù)據(jù)。

1.3.4.2 分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌基因組DNA提?。簯?yīng)用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，提取產(chǎn)物經(jīng)過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：Template 0.5 μL，Buffer 2.5 μL, dNTP 1 μL, 酶0.2 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL， PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件，94 ℃ 4 min預(yù)變性；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 修復(fù)延伸10 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank基因數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較分析，鑒定出微生物種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵香腸中的微生物數(shù)量

為了分析發(fā)酵香腸中的微生物數(shù)量，對其中的主要微生物數(shù)量進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)，所得結(jié)果見圖1。

圖1 樣品中微生物數(shù)量Fig.1 Number of microorganisms in sample

由圖1可知，香腸中含有乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母菌，其中乳酸菌為香腸中的優(yōu)勢菌落，數(shù)量為(7.21±0.33)log CFU/g，其次為微球菌。

由于香腸配方中添加了含有微生物的輔料醪糟，其中所自帶的發(fā)酵微生物在香腸中繼續(xù)生長。因此，各種微生物的含量比一般香腸高，但低于添加工業(yè)發(fā)酵劑的發(fā)酵香腸[11,12]。MRS培養(yǎng)基中生長的乳酸菌量較多，這就使乳酸菌的分離更加容易。

2.2 乳酸菌的分離純化

通過對MRS平板中菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，選取了3種形態(tài)有差異的菌落進(jìn)行分離純化。這3種菌在經(jīng)過反復(fù)挑取單個菌落，并在MRS平板中劃線，最終獲得了平板與鏡下形態(tài)一致的菌落。這3種菌平板上的形態(tài)表現(xiàn)出一定的差異，各種菌落的形態(tài)特征描述見表1。

表1 3株菌的形態(tài)特性Table 1 Morphological characteristics of three strains of bacteria

2.3 乳酸菌的微生物鑒定系統(tǒng)鑒定

為了進(jìn)一步明確所得3株菌的種屬，采用微生物鑒定系統(tǒng)對其進(jìn)行了鑒定。GENⅢ微孔板使用固定在微孔板上的94個不同的生化試驗來對廣泛的革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌提供表型概況并進(jìn)行鑒定，Biolog鑒定系統(tǒng)中的軟件通過讀取GENⅢ微孔板上所表現(xiàn)出來的表型圖譜來對細(xì)菌進(jìn)行鑒定。最終經(jīng)過系統(tǒng)比對，給出最有可能的微生物種類。

3株菌接種GENⅢ 鑒定板24 h后，放置于微生物鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行讀數(shù)鑒定，鑒定板經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，對碳源利用后顯色見圖2。

圖2 GENⅢ微孔板24 h表型圖譜Fig.2 24 h phenotypic spectrum of GEN III microporous plate

注：全灰色為陽性，半灰色為弱陽性，白色為陰性。

通過微生物鑒定系統(tǒng)讀數(shù)后分析，1號菌95.3%可能性為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，2號菌90.4%可能性為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，3號菌94.1%可能性為腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。

2.4 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步驗證所得微生物的種屬，對純化得到的3株菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照，結(jié)果見圖3。

圖3 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖 Fig.3 Electropherogram of 16S rDNA PCR products

圖3中DNA的分子量大小數(shù)據(jù)顯示，在約為1500 bp處出現(xiàn)了熒光條帶，將產(chǎn)物送至測序公司測序，將所得到的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性分析，結(jié)果見表2。

表2 3株菌的序列分析Table 2 Sequence analysis of three strains of bacteria

經(jīng)過對3株菌的序列測定后，可知1號菌為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，2號菌為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，3號菌為腸膜明串珠菌，該結(jié)果只有2號菌與微生物鑒定系統(tǒng)的結(jié)果有差異，另外兩株結(jié)果一致。由結(jié)果可知，生理生化鑒定在一定程度上與分子生物學(xué)鑒定保持一致，在實驗室可作為微生物鑒定中的輔助方法。

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是一種典型的乳酸菌，常被用于制作奶酪等乳制品，具有提高奶酪感官特性的作用[13]，也常在發(fā)酵香腸中被分離到[14]。這種菌株若攜帶耐藥基因，隨著飲食進(jìn)入人體，會通過水平轉(zhuǎn)移傳遞給其他腸道基因[15]。目前已有研究人員將耐藥性低、生物胺產(chǎn)量少的糞腸球菌應(yīng)用于發(fā)酵香腸的制作，所制作出的香腸，感官上沒有顯著的變化，但是干燥結(jié)束后腸桿菌、金黃色葡萄球菌和革蘭氏陽性菌含量降低，對單增李斯特菌產(chǎn)生抑制作用，為發(fā)酵香腸的生物保存的提供了一種有益菌[16]。因此，在保證安全性前提下，糞腸球菌對發(fā)酵香腸的保存具有積極作用。

戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)是發(fā)酵肉制品中常見的乳酸菌[17，18]，對發(fā)酵香腸中的蛋白水解有一定影響[19]。含有戊糖片球菌作為發(fā)酵劑的香腸，可增加萜類及含硫類風(fēng)味物質(zhì)[20，21]。腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)是乳酸菌中明串珠菌屬的重要菌種，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生多種酸和醇，具有高產(chǎn)酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力。一般在發(fā)酵乳制品、青貯、泡菜、果酒中[22]，在發(fā)酵肉制品中的報道還不多見。腸膜明串珠菌屬于異形發(fā)酵乳酸菌，只將50%的糖轉(zhuǎn)化成乳酸，其余的糖則轉(zhuǎn)變成酒精、醋酸及二氧化碳。在某些微生物酶的作用下，有些糖會被聚合成多糖，使香腸形成良好的風(fēng)味[23]。由研究結(jié)果可知，這3株乳酸菌在香腸的風(fēng)味、色澤、安全性、貯存性等方面均具有積極的作用，具有一定的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

通過對四川傳統(tǒng)香腸中幾株乳酸菌的分離、純化，結(jié)合微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生理生化鑒定及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，得到了糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)3種乳酸菌。這3株乳酸菌在傳統(tǒng)香腸中均具有產(chǎn)生乳酸，降低產(chǎn)品pH值的作用，對于產(chǎn)品的發(fā)色、風(fēng)味及亞硝酸鹽等有積極的作用。因此，四川傳統(tǒng)香腸的品質(zhì)、質(zhì)量及安全性與其中所含有的乳酸菌有著密不可分的關(guān)系。該研究中所分離得到的3種乳酸菌，為制備生物源乳酸單體提供了菌種，并為開發(fā)肉制品發(fā)酵劑及傳統(tǒng)肉制品加工提供了參考。