馮倩，曾里，冉旭*，高安友，應(yīng)萍輝

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065；2.四川省新溪源生物科技發(fā)展有限公司，成都 618500)

鯰魚，同鲇魚，種類繁多，適應(yīng)能力好，容易養(yǎng)殖，成本低廉[1]，其體內(nèi)含有豐富的亞油酸、亞麻酸等構(gòu)成人腦極為重要的一系列營(yíng)養(yǎng)素，具有一定的調(diào)中、益陽(yáng)的藥用功效[2]。近年來(lái)有關(guān)利用生物酶解技術(shù)生產(chǎn)魚類發(fā)酵制品的研究越來(lái)越多[3,4]，研究發(fā)現(xiàn)生物酶解不僅效率高、污染低，而且酶解產(chǎn)物包含許多人體必需的氨基酸[5]。另一方面，通過(guò)酶解可以得到具有抗氧化活性、能夠緩解體力疲勞和降血壓等功能性的更利于人體吸收的小分子多肽[6]。但目前對(duì)于鯰魚酶解多采用單酶水解，因而存在底物水解不完全和利用率較低的問(wèn)題。另外，對(duì)酶解后的多肽及氨基酸做進(jìn)一步的分析以開(kāi)發(fā)鯰魚發(fā)酵產(chǎn)品的研究還鮮有報(bào)道[7]。因此，本文對(duì)鯰魚進(jìn)行雙酶復(fù)合酶解，然后應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解制備鯰魚多肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，再對(duì)酶解液進(jìn)行氨基酸分析和多肽分子量評(píng)價(jià)，以期為后續(xù)鯰魚相關(guān)的發(fā)酵制品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

鯰魚：由四川溪源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供；木瓜蛋白酶(80×104U/g)、中性蛋白酶(5×104U/g)：Solarbio公司；其他試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密數(shù)顯pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)有限公司；KDN-C 定氮爐 浙江托普儀器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ELEOS System凝膠色譜儀 美國(guó)Wyatt公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

新鮮鯰魚解凍后，去除魚頭、內(nèi)臟和魚皮，將洗凈后的魚肉以小袋分裝，于-20 ℃下保存，備用。

1.3.2 原料最佳酶添加量的選擇

選用酶切位點(diǎn)為疏水性大分子氨基酸Leu、Ile、Phe的中性蛋白酶和酶切位點(diǎn)為Arg、Lys、Gly、Cys殘基羧基參與形成肽鍵的木瓜蛋白酶，添加不同比例以確定最佳酶添加量[8-13]。

1.3.3 酶解鯰魚肉的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定量的鯰魚肉，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)添加中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為1∶1作為本試驗(yàn)酶的添加量。分別對(duì)酶解pH、溫度、時(shí)間和料液比4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析，衡量指標(biāo)為鯰魚肉的水解度及多肽得率。

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取鯰魚多肽工藝參數(shù)

鯰魚多肽提取工藝的設(shè)計(jì)因素及水平編碼見(jiàn)表1。

表1 鯰魚多肽提取工藝的設(shè)計(jì)因素及水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 水解度的測(cè)定

1.3.4.1 總氮的測(cè)定

參照GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法測(cè)定鯰魚肌肉的總氮含量。

1.3.4.2 游離氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

參考GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的酸度計(jì)法，并稍加修正[14]。吸取5.0 mL酶解液，加入50 mL去離子水稀釋，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mol/L)調(diào)節(jié)pH至8.2，再加入10.0 mL甲醛溶液(38%，V/V)，混勻靜置5 min，繼續(xù)滴定至pH為9.2，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(V1，mL)；以去離子水作空白，采用同樣的操作方法，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(V0，mL)。酶解液中游離氨基酸態(tài)氮的含量(CN，g/dL)計(jì)算公式如下：

CN=(V1-V0)×C×0.014/5。

式中：CN為酶解液中游離氨基態(tài)氮的含量，g/mL；C 為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V1為酶解液加入甲醛后滴定消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0為空白液加入甲醛后滴定消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；0.014為1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g。

1.3.4.3 水解度的計(jì)算

DH=CN×V/總氮。

式中：CN為酶解液中游離氨基酸態(tài)氮的含量，g/mL；V為酶解液總體積，mL。

1.3.5 多肽含量的測(cè)定

魯偉等[15]采用加入等量10%(W/V)三氯乙酸(TCA)沉淀大分子蛋白后，再采用雙縮脲法測(cè)定酶解液中肽的含量。本試驗(yàn)參照此法并稍作改變。

1.3.5.1 雙縮脲試劑的配制

稱取硫酸銅(CuSO4·5H2O)3 g、酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)9.0 g、碘化鉀5.0 g、氫氧化鈉24 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，搖勻，即得雙縮脲試劑。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水定量稀釋成蛋白質(zhì)含量分別為1，2，3，4，5 mg/mL的溶液。取5 mL溶液于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，混勻，用軟塞塞住上管口，置于37 ℃水浴中30 min。然后以超純水調(diào)零，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.5.3 多肽含量的測(cè)定與計(jì)算

精密量取稀釋一定濃度后的樣品液5 mL，其余方法同1.3.5.2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出多肽含量(mg/mL)。

1.3.6 游離氨基酸的測(cè)定與分析

利用A300德國(guó)MembraPure氨基酸分析儀，采用570 nm和440 nm雙檢測(cè)通道對(duì)樣品進(jìn)行分析。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確判斷評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可通過(guò)WHO/FAO提出的氨基酸模式譜來(lái)計(jì)算樣品中的必需氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)、比值系數(shù)分(SRC)[16-18]。

1.3.7 多肽相對(duì)分子質(zhì)量的分布測(cè)定

采用ELEOS System型凝膠色譜儀(色譜柱為ShodexOHpak系列SB-806串803)進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，選擇柱溫40 ℃、流速1 mL/min、進(jìn)樣量500 μL[19-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解條件對(duì)鯰魚蛋白水解度及多肽的率得影響

圖1 pH、料液比、酶解溫度及酶解時(shí)間對(duì)鯰魚酶解液水解度和多肽含量的影響Fig.1 Effect of pH values, solid-liquid ratios, enzymolysis temperatures and enzymolysis time on the degree of hydrolysis and peptide content

由圖1可知，在酶解過(guò)程中，水解度與多肽含量隨著條件的變化都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。由圖1中A可知，pH為6時(shí)，水解度和多肽含量都達(dá)到最大值，可能是因?yàn)槠渚谥行缘鞍酌负湍竟系鞍酌傅淖钸mpH范圍內(nèi)。由圖1中B可知，隨著溶劑量的增多，更多的多肽被水解出來(lái)，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，由于溶液體積的增大導(dǎo)致多肽含量明顯下降，再考慮到試驗(yàn)操作的損耗以及后期試驗(yàn)的方便性，選擇料液比為1∶4時(shí)最佳。酶的催化活性受溫度的影響較大，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶都有各自的最適反應(yīng)溫度，由圖1中C可知，在55 ℃時(shí)，水解度趨于平穩(wěn)，同時(shí)多肽含量達(dá)到最大值，隨即顯著降低，可能是因?yàn)檫^(guò)度水解導(dǎo)致小分子多肽也開(kāi)始被消耗。反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解的影響見(jiàn)圖1中D，由于酶解底物量的限制以及酶活的自我損失，當(dāng)酶解到300 min時(shí)，水解度已經(jīng)慢慢達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，然而之后由于小分子多肽也開(kāi)始被水解為氨基酸，導(dǎo)致多肽含量開(kāi)始降低。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的原理，選擇對(duì)結(jié)果影響較大的料液比、pH、酶解溫度作為自變量X1、X2、X3，酶解得到的多肽含量Y為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，見(jiàn)表2，采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，可以得到料液比、pH和溫度對(duì)多肽得率影響的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=3.17-0.3095A+0.0233B+0.0290C-0.0123AB+0.0022AC+0.0019BC-0.2346A2-0.1044B2-0.0872C2。

表2 鯰魚酶解工藝的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment of enzymatic hydrolysis for catfish

鯰魚蛋白的回歸模型各項(xiàng)系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果及方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

注：“*”表示差異顯著，P<0.05；“**”表示差異極顯著，P<0.01。

由表3可知，該回歸模型的P<0.0001，其中，失擬項(xiàng)值為0.6327，>0.5，表現(xiàn)為不顯著。綜上表明所設(shè)計(jì)的三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)是可行的，方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9835，相關(guān)系數(shù)RAdj2=0.9623，表明該模型的擬合度較好，能夠在96.23%的程度上解釋試驗(yàn)結(jié)果；變異系數(shù)為1.74%，表明該模型能夠很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值；精密度為17.0792，>4.0，表明其是一個(gè)適宜的信號(hào)值。

圖2 pH值和料液比交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface figure and contour plot of interaction effect of pH value and solid-liquid ratio

由圖2可知，隨著料液比或pH值的增加，多肽得率都先增加，達(dá)極大值后減小，這與單因素結(jié)果保持一致。

圖3 酶解溫度和料液比交互作用的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface figure and contour plot of interaction effect of enzymolysis temperature and solid-liquid ratio

由圖3可知，料液比的曲線比酶解溫度的曲線更陡，表明料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大于酶解溫度的顯著性。

由圖4可知，當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，多肽得率隨pH值的增加先升高后降低。

圖4 酶解溫度和pH值交互作用的響應(yīng)面圖和等高線Fig.4 Response surface figure and contour plot of interaction effect of enzymolysis temperature and pH value

根據(jù)上述響應(yīng)面優(yōu)化得到鯰魚酶解液多肽含量的最佳提取條件為：料液比1∶2.673，pH值6.076，酶解溫度56.595 ℃，多肽得率預(yù)測(cè)值為3.279 mg/mL?？紤]到實(shí)際操作條件，將最佳酶解工藝條件修正為：料液比1∶2.7，pH值6，酶解溫度57 ℃。進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下，鯰魚酶解液多肽含量平均值為3.165 mg/mL，非常接近于預(yù)測(cè)值。這說(shuō)明該回歸模型能夠較好地反映鯰魚酶解液多肽含量的變化規(guī)律。

2.3 氨基酸分析結(jié)果

表4 鯰魚酶解液中的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of catfish enzymatic hydrolysate

表5 各種必需氨基酸的RAA、RC及SRCTable 5 RAA, RC and SRC of human essential amino acids

由表4和表5可知，水解后鯰魚樣品中氨基酸的種類齊全，其中必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)的比值(EAA/NEAA)為57.45%，較接近于FAO/WHO所提出的比值40%。為了進(jìn)一步說(shuō)明鯰魚酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，采用氨基酸比值系數(shù)法對(duì)酶解液中各種必需氨基酸進(jìn)行了進(jìn)一步分析。鯰魚酶解液中各種必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)以及比值系數(shù)分(SRC)見(jiàn)表5，可知鯰魚酶解液氨基酸的比值系數(shù)分較高，為83.2，這為后續(xù)進(jìn)一步加工利用提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

2.4 多肽相對(duì)分子質(zhì)量的分布

圖5 分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution

由圖5可知，鯰魚酶解液中多肽分子峰尖分子量為1.100×103g/mol，數(shù)均分子量為1.842×103g/mol，平均分子量為1.334×103g/mol，多分散性指數(shù)為1.651。酶解液中多肽分子量分布在700.0～28922.0 g/mol之間，其中，多肽分子量在700.0～2800.0 g/mol之間占總多肽分子量含量的53%；多肽分子量在2800.0～3200.0 g/mol之間，占總多肽分子量含量的28.6%，說(shuō)明酶解后的多肽分子含量主要以3000.0 g/mol以下的小分子肽為主，水解程度較好。具體分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。

表6 凝膠色譜結(jié)果分析Table 6 Analysis of gel chromatography results

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，得到料液比1∶2.7、pH值6、酶解溫度57 ℃和酶解時(shí)間300 min為鯰魚酶解的最佳條件，在此條件下鯰魚酶解液的多肽含量平均值為3.165 mg/mL。鯰魚經(jīng)過(guò)酶解后，人體必需氨基酸含量大幅上升，其中必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)的比值(EAA/NEAA)為57.45%，氨基酸比值系數(shù)分SRC為83.2，符合FAO/WHO所提出的蛋白評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)GPC凝膠色譜儀對(duì)樣品進(jìn)一步的檢測(cè)分析可知，鯰魚酶解液中多肽分子平均分子量為1.334×103g/mol，主要以3000.0 g/mol以下的多肽為主。該研究確定了一種水解程度較高、營(yíng)養(yǎng)豐富、容易吸收消化的鯰魚酶解液的制備方法，可為后續(xù)鯰魚相關(guān)發(fā)酵制品的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。