張怡，李榮*，姜子濤,2

(1.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134; 2.天津天獅學(xué)院 食品工程學(xué)院，天津 301700)

草豆蔻(AlpiniakatsumadaiHayata)俗名草蔻，為我國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味香料，是鹵制肉制品必不可少的調(diào)味香料之一[1,2]。關(guān)于草豆蔻的化學(xué)成分已有部分文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]，但研究主要集中在黃酮和二苯基庚烷類(lèi)化合物的分離分析[6-8]，以及提取物的抗腫瘤、抗氧化和抑菌活性[9-12]。目前已報(bào)道的草豆蔻精油(AKEO)提取方法有水蒸氣蒸餾法、索氏提取法、超臨界二氧化碳流體萃取法等[13-15]，以上方法均具有提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低等缺點(diǎn)。

本研究采用超聲微波輔助協(xié)同提取技術(shù)提取了AKEO，使提取時(shí)間由通常的數(shù)小時(shí)縮短到幾分鐘；并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法確定AKEO提取的最佳條件。為提升AKEO的穩(wěn)定性，制備了β-環(huán)糊精鉀有機(jī)骨架(K-β-CD-MOF)與AKEO包結(jié)物(K-β-CD-MOF-AKEO)。AKEO被包結(jié)后減少了與氧氣的接觸，進(jìn)而達(dá)到了長(zhǎng)期存放和緩釋的目的，同時(shí)也增大了其在加熱、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等條件下的穩(wěn)定性。本文探討了包結(jié)作用機(jī)制，對(duì)于指導(dǎo)AKEO與K-β-CD-MOF的包結(jié)反應(yīng)，為AKEO的開(kāi)發(fā)及在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草豆蔻：購(gòu)于云南，粉碎成約40目備用。β-環(huán)狀糊精(β-CD)：上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站聯(lián)營(yíng)企業(yè)中心化工廠；甲醇(分析純)、無(wú)水乙醇：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；無(wú)水硫酸鈉：天津市科密歐科技有限公司；氫氧化鉀：天津市化學(xué)試劑三廠；實(shí)驗(yàn)用水均為純凈水，利用純水機(jī)自制(上海Heal Force公司)。

U-3900 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本株式會(huì)社日立制作所；CW2000超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀 上海新拓微波公司；B203生物光學(xué)顯微鏡 重慶市奧特儀器有限公司；WE-1水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AKEO的超聲-微波協(xié)同提取工藝

稱(chēng)取15.0 g草豆蔻粉末于提取瓶中，以蒸餾水為提取溶劑采用微波超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取。提取溫度設(shè)定為100 ℃，超聲功率為50 W(儀器固定)，在一定微波功率、提取時(shí)間和液料比下進(jìn)行提取。蒸餾至無(wú)油量增加，收集水面上層精油，使用適量無(wú)水硫酸鈉去除水分，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后儲(chǔ)存于棕色瓶中，放置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 AKEO超聲-微波協(xié)同提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 液料比對(duì)精油提取率的影響

固定微波功率600 W，提取時(shí)間為7 min，分別設(shè)定液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)，收集精油并計(jì)算精油提取率(n=3)。

1.2.2.2 微波時(shí)間對(duì)精油提取率的影響

固定微波功率600 W，液料比為10∶1(mL/g)，微波時(shí)間分別設(shè)定為4，5，6，7，8 min，收集精油并計(jì)算精油提取率(n=3)。

1.2.2.3 微波功率對(duì)精油提取率的影響

固定液料比10∶1(mL/g)，提取時(shí)間為7 min，分別在微波功率400，500，600，700，800 W 下進(jìn)行提取，收集精油并計(jì)算精油提取率(n=3)。

1.2.3 AKEO提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及Box-Behnken中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取微波功率、微波時(shí)間、液料比為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的考察因素并對(duì)因素范圍進(jìn)行優(yōu)化，以精油提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。其中，每個(gè)因素3個(gè)水平，中心實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels design of response surface experiment

1.2.4 K-β-CD-MOF的合成

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16,17]中的方法并稍作修改，稱(chēng)取1.300 g β-CD和0.450 g氫氧化鉀于小燒杯中，加入20 mL蒸餾水充分?jǐn)嚢枞芙?，全部溶解后將燒杯放入裝有100 mL無(wú)水甲醇的層析缸中密封。于室溫條件下靜置1周，在此期間甲醇蒸汽緩慢擴(kuò)散進(jìn)入溶液，在燒杯中生長(zhǎng)出無(wú)色立方晶體K-β-CD-MOF，用無(wú)水乙醇洗滌3次后干燥即可。

1.2.5 AKEO與K-β-CD-MOF的包結(jié)作用

根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]中的方法并稍作修改，在比色管中分別加入2 mL 0.002 mol/L精油溶液(用70%的乙醇配制)，再依次加入0，0.2，0.5，1，2，3，4，5 mL 0.01 mol/L的K-β-CD-MOF溶液，加入適當(dāng)無(wú)水乙醇，再用蒸餾水定容到10 mL，保持乙醇體積濃度為35%，在20～50 ℃下恒溫水浴振蕩30 min，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算平衡常數(shù)及熱力學(xué)常數(shù)。

包結(jié)常數(shù)(K)采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。可由Hildebrand-Benesi方程得到包結(jié)物的K值[19]；依據(jù)Van't Hoff方程以及K與標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算包結(jié)過(guò)程的ΔH、△S和△G。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)精油提取的影響

考察了液料比、微波時(shí)間及微波功率對(duì)草蔻精油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 單因素對(duì)AKEO提取率的影響Fig.1 Effect of single factor on extraction rate of AKEO

由圖1中a可知，隨著液料比的增大，提取率隨蒸餾水比例變大先增高后降低，在液料比為10∶1時(shí)得到最大值。當(dāng)液料比過(guò)大時(shí)，可能是水量的加大使得精油在水中的溶解度增大，導(dǎo)致精油的提取率降低[20]；液料比過(guò)小時(shí)，易造成原料浸泡不充分，局部過(guò)熱，使得原料發(fā)生炭化[21,22]，造成精油提取率降低。

由圖1中b可知，在5～9 min內(nèi)，精油提取率隨時(shí)間的增加先升高后降低。當(dāng)微波時(shí)間低于7 min時(shí)，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，微波輻射對(duì)物料細(xì)胞的破壞作用呈累積形式增加，對(duì)物料進(jìn)行充分作用[25]，釋放出的物質(zhì)增多造成提取率增加。微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能造成精油氧化或降解等現(xiàn)象，造成提取率降低[26]。因此，微波時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)選取7 min進(jìn)行下一步優(yōu)化。

由圖1中c可知，在一定微波時(shí)間和一定液料比下，隨著微波功率的升高，提取率先增大后降低，在600 W時(shí)得到最大值。當(dāng)微波功率在400～600 W時(shí)，可能是因?yàn)榉磻?yīng)混合體系在微波作用下產(chǎn)生大量氣泡，有利于溶劑的浸入，促進(jìn)對(duì)物料細(xì)胞的穿透作用[23]，達(dá)到精油提取率的提高。當(dāng)微波功率高于600 W，微波產(chǎn)生的熱效應(yīng)過(guò)強(qiáng)，可能導(dǎo)致部分精油揮發(fā)損失[24]，造成提取率下降。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，確定微波功率(A)、微波時(shí)間(B)、液料比(C)3個(gè)主要影響因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

續(xù) 表

2.2.2 回歸方程的建立及方差分析

用Design Expert軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以精油提取率Y為響應(yīng)值，以A微波功率、B微波時(shí)間、C液料比為自變量的回歸方程為：Y=0.41-0.014A+0.023B- 0.014C+0.015AB+0.038AC+0.05BC-0.026A2-0.044B2-0.051C2，回歸模型方差分析結(jié)果以及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA of the regression model

注：P<0.05表示影響顯著；P<0.01表示影響極顯著。

對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得出以下結(jié)果：整個(gè)回歸模型是極顯著的(P<0.01)，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，表明該模型擬合性較好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9761，具有顯著意義，該模型可用于對(duì)AKEO的提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。在此模型影響因素中，具有8個(gè)顯著項(xiàng)，A，C顯著，B極顯著，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選取的3個(gè)單因素對(duì)AKEO得率具有顯著影響；其交互因素AC、BC即微波功率和液料比、微波時(shí)間和液料比之間的交互作用對(duì)精油得率具有極顯著影響；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)精油得率具有極顯著影響。

2.2.3 響應(yīng)面曲面圖分析

通過(guò)Design Expert軟件處理回歸方程，根據(jù)回歸分析結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖2。

a.微波功率和微波時(shí)間

b.微波功率和液料比

c.微波時(shí)間和液料比

由圖2中a可知，等高線(xiàn)向微波時(shí)間軸變化更為密集，且微波時(shí)間3D曲面變化更為陡峭，說(shuō)明微波時(shí)間對(duì)精油提取率的影響更為顯著，且隨著微波時(shí)間的增加，精油提取率先提高后降低，在微波時(shí)間為7 min左右，微波功率為550 W左右時(shí)，達(dá)到最大值。由圖2中b可知，等高線(xiàn)向微波功率和液料比兩軸變化一致，且曲面變化較為一致，在二者協(xié)同作用下，當(dāng)微波功率達(dá)到550 W附近，液料比8∶1左右時(shí)，精油提取率最高。由圖2中c可知，等高線(xiàn)向微波時(shí)間軸方向變化更為密集，且微波時(shí)間3D曲面變化更為陡峭，說(shuō)明微波時(shí)間對(duì)精油提取率有顯著影響，在二者的協(xié)同作用下，在液料比為5∶1～10∶1，微波時(shí)間在6～7 min之間，微波時(shí)間越長(zhǎng)，液料比越高，會(huì)使溶劑對(duì)細(xì)胞的損壞程度加劇，有利于精油提取率的增大。

2.2.4 最佳提取條件的確定

通過(guò)模型預(yù)測(cè)得到的最佳AKEO提取條件為：微波功率550.6 W，微波時(shí)間6.99 min，液料比8.40∶1 (mL/g)，預(yù)測(cè)AKEO的提取率為0.42%?？紤]實(shí)驗(yàn)的可操作性，修正為微波功率550 W，微波時(shí)間7 min，液料比8∶1 (mL/g)。為驗(yàn)證回歸模型預(yù)測(cè)的結(jié)果，選取修正后的條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，精油提取率平均為0.4%，與預(yù)測(cè)值相近，相對(duì)誤差為4.8%。由此看見(jiàn)，該優(yōu)化條件可用于AKEO的提取。

2.3 包結(jié)常數(shù)的測(cè)定

2.3.1 AKEO與K-β-CD-MOF體系的紫外吸收光譜

在相同光譜條件下，測(cè)定了AKEO與不同濃度K-β-CD-MOF溶液形成的包結(jié)物的紫外分光光譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度的K-β-CD-MOF溶液對(duì)精油吸光度值的影響Fig.3 Effect of K-β-CD-MOF solution with different concentration on the absorbance of essential oil

注：K-β-CD-MOF濃度(圖中1→6)分別為0×10-3，0.2×10-3，0.5×10-3，1×10-3，2×10-3，3×10-3mol/L。

由圖3可知，在波長(zhǎng)278 nm處，隨著K-β-CD-MOF溶液濃度的增加，精油的最大吸收波長(zhǎng)略有紅移，這種現(xiàn)象說(shuō)明精油進(jìn)入K-β-CD-MOF空腔后，與其產(chǎn)生多種作用力，如氫鍵、范德華力等，對(duì)其電子云產(chǎn)生干擾，造成最大吸收波長(zhǎng)紅移以及吸光度上升。最高吸收峰的吸光度增加也表明精油與K-β-CD-MOF形成了包結(jié)物[20]。

2.3.2 AKEO與K-β-CD-MOF包結(jié)

根據(jù)Hildebrand-Benesi方程進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合(n取值1～5)，擬合結(jié)果表明當(dāng)n=1時(shí)，AKEO與K-β-CD-MOF體系的雙倒數(shù)圖線(xiàn)性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)圖4。說(shuō)明AKEO與K-β-CD-MOF包結(jié)過(guò)程中形成了1∶1型包結(jié)物。包結(jié)物的形成為動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，包結(jié)常數(shù)受反應(yīng)溫度影響。根據(jù)范特霍夫方程作圖并計(jì)算得到包結(jié)反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)，不同反應(yīng)溫度下的包結(jié)常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。

圖4 不同溫度下精油與K-β-CD-MOF體系的雙倒數(shù)圖Fig.4 Double reciprocal plot of essential oil and K-β-CD-MOF systems at different temperatures

表4 AKEO與K-β-CD-MOF包結(jié)過(guò)程的包結(jié)常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Inclusion constants and thermodynamic parameters of AKEO and K-β-CD-MOF during inclusion process

由表4可知，ΔH>0，隨著溫度的逐漸升高，包結(jié)物的K值逐漸增大，說(shuō)明該反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，在包合物制備時(shí)可選擇在較高溫度進(jìn)行，升溫有利于該包結(jié)物的形成；ΔG<0，表明該包結(jié)物自發(fā)形成，為自發(fā)反應(yīng)，隨著溫度的升高，負(fù)值逐漸變大，包結(jié)反應(yīng)自發(fā)傾向增大；ΔS>0，可能是因?yàn)榫头肿颖话贙-β-CD-MOF空腔內(nèi)，使得溶液系統(tǒng)中精油分子減少，使得熵減少，同時(shí)客體分子進(jìn)入空腔后，一些水分子被釋放出來(lái)，導(dǎo)致熵的增加。由于熵增加效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于熵減少效應(yīng)，因此結(jié)果為熵增加[28]。同時(shí)也表明該包結(jié)過(guò)程中疏水作用起著重要的作用[29]。ΔH>0且ΔS>0，根據(jù)吉布斯-赫姆霍茲公式說(shuō)明該反應(yīng)為熵效應(yīng)驅(qū)動(dòng)過(guò)程[30]。

3 結(jié)論

本研究首先利用單因素實(shí)驗(yàn)確定了提取AKEO的條件優(yōu)化范圍，進(jìn)一步通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到最佳提取條件。制備了以K-β-CD-MOF為壁材的K-β-CD-MOF-AKEO，研究其與AKEO的包結(jié)作用，結(jié)果表明K-β-CD-MOF與AKEO的包結(jié)比為1∶1，包結(jié)后AKEO最大吸收波長(zhǎng)紅移，吸光度規(guī)律性增大，可證明包結(jié)物的形成。熱力學(xué)參數(shù)則表明該反應(yīng)為吸熱的保留自發(fā)反應(yīng)，溫度的升高有利于包結(jié)反應(yīng)的發(fā)生。