倪玉佳，湯 露，戈 煜，董文燊，瞿發(fā)林

0 引 言

醋酸氯己定洗劑、復(fù)方樟腦搽劑、含酚爐甘石涂劑及復(fù)方硝酸咪康唑軟膏均為我院自制外用制劑，分別已取得制劑批準(zhǔn)文號(hào)［南制字（2016）B513004、南制字（2016）B513007、南制字（2016）B513006、總制字（2019）F513008］，臨床療效顯著。國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的2015年版《中國(guó)藥典》，對(duì)藥品提出了更高的檢驗(yàn)要求［1-2］，醫(yī)院制劑在微生物驗(yàn)證方面存在巨大的挑戰(zhàn)。眾所周知，外用制劑常含乙醇、苯酚、樟腦、抗生素等抑菌成分，同時(shí)為了防止制劑因微生物污染引起腐敗變質(zhì)，常常加入防腐劑延長(zhǎng)制劑有效期，而這些物質(zhì)常有較強(qiáng)的抑菌作用，會(huì)對(duì)微生物限度檢查方法的建立帶來(lái)極大的困難。含抑菌成分的外用制劑若采用平皿法，試驗(yàn)菌回收率難以達(dá)到要求，故參照文獻(xiàn)［3-5］中的方法，采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，為我院四種外用制劑建立了方便可靠、快速便捷的微生物限度檢驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器電子天平（設(shè)備型號(hào)：EL-300J，常州天之平儀器設(shè)備公司）；潔凈工作臺(tái)（設(shè)備型號(hào)：SM-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（設(shè)備型號(hào)：303-3B，南通科學(xué)儀器廠）；霉菌培養(yǎng)箱（設(shè)備型號(hào)：SPX-150B，上海浦東榮豐儀器公司）；電熱恒溫水浴鍋（設(shè)備型號(hào)：HHS，上海醫(yī)療器械五廠）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（設(shè)備型號(hào)：LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.1.2 制劑A：醋酸氯己定洗劑（規(guī)格：200 mL；批號(hào)：20170411、20170615、20170714）；B：復(fù)方樟腦搽劑（規(guī) 格：100 mL；批 號(hào)：20170322、20170922、20180228）；C：含酚爐甘石涂劑（規(guī)格：100 mL；批號(hào)：20170329、20170922、20180322）；D：復(fù)方硝酸咪康唑軟膏（原菌克軟膏）（規(guī)格：20 g；批號(hào)：20180118、2018323、20180426）。上述制劑為本院自制。

1.1.3 菌株金黃色葡萄球菌［編號(hào)CMCC（B）26003，批號(hào)26003-5a28-5］、枯草芽孢桿菌［編號(hào)CMCC（B）63501，批號(hào)63501-2a22-1］、銅綠假單胞菌［編號(hào)CMCC（B）10104，批號(hào)10104-2a20-3］、白色念珠菌［編號(hào)CMCC（B）98001，批號(hào)98001-2a15-3］及黑曲霉菌［編號(hào)CMCC（F）98003，批號(hào)0A1001］為0 代凍干粉，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，活化后使用。

1.1.4 培養(yǎng)基及稀釋劑培養(yǎng)基分別為：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)分別 為160802、1609262、161113、161017、160309、160226）。稀釋劑：pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：160801）。均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.5 試劑十四烷酸異丙酯（批號(hào)：20170807）、聚山梨酯80（批號(hào)：20170925），由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌液依照2015年版《中國(guó)藥典》所要求的制備方法，分別制成試驗(yàn)所需的菌懸液濃度［6］。

1.2.2 供試液A（醋酸氯己定洗劑）：供試品原液。B（復(fù)方樟腦搽劑）及C（含酚爐甘石涂劑）：各取10 mL 供試品，加pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液適量，使得共100 mL，混合均勻，制成1∶10 的供試液。D（復(fù)方硝酸咪康唑軟膏）：取50 g軟膏加入50 mL無(wú)菌十四烷酸異丙酯，研磨5 min 后加入少許無(wú)菌含10%聚山梨酯80［7］的pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，繼續(xù)研磨5 min后加入500 mL已預(yù)熱的（44℃）無(wú)菌含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，水浴保溫（44℃）靜置40 min，得到1∶10的溶液，取水層作為供試液。

1.2.3 微生物計(jì)數(shù)檢查方法的驗(yàn)證①試驗(yàn)組：A制劑，取供試液原液100 mL，加入相應(yīng)試驗(yàn)菌1 mL（菌終濃度不大于100 cfu/mL），混勻。B、C 制劑，各取“1.2.2”項(xiàng)下供試液100 mL，加入相應(yīng)試驗(yàn)菌1 mL（菌終濃度不大于100 cfu/mL），混勻。以上混勻液體，各取1 mL（每膜），薄膜過(guò)濾，用pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗次數(shù)分別為10 次、5次、4 次，每次沖洗量為100 mL。轉(zhuǎn)移試驗(yàn)濾膜且菌面朝上，貼于對(duì)應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。D 制劑，取已制得的1∶10 供試液50 mL，分別加入各試驗(yàn)菌0.5 mL（菌液終濃度不大于100 cfu/mL），混勻后1 mL 過(guò)膜，取500 mL pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（含1%聚山梨酯80）分5 次沖洗，沖洗結(jié)束后貼于對(duì)應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。②供試品對(duì)照組：取制備好的供試液，用稀釋液替代所加菌液，操作方法同試驗(yàn)組。③菌液對(duì)照組：用稀釋液替代所加供試液，具體操作同試驗(yàn)組。④回收率計(jì)算：計(jì)算各對(duì)應(yīng)試驗(yàn)菌的回收率比值?；厥章蔙 需在0.5～2 之間，否則表明驗(yàn)證方法不適宜?；厥章蔙計(jì)算公式：

1.2.4 控制菌檢查驗(yàn)證因四種制劑為外用制劑，故而控制菌試驗(yàn)涉及到銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌的方法驗(yàn)證。①試驗(yàn)組：A 制劑兩種控制菌皆采用薄膜過(guò)濾法，取供試液1 mL 每膜，1000 mL pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每次100 mL，沖洗10 次；B、C 制劑采用薄膜過(guò)濾法，取1∶10 供試液10 mL 每膜，300 mL pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每次100 mL，沖洗3 次；D 制劑，銅綠假單胞菌采用常規(guī)法，金黃色葡萄球菌采用薄膜過(guò)濾法，取1∶10 供試液10 mL 每膜，500 mL 含1%聚山梨酯80的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每次100 mL，沖洗5 次。以上試驗(yàn)組均加入不大于100cfu 的試驗(yàn)菌，且D 制劑金黃色葡萄球菌檢查試驗(yàn)于200 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其余控制菌的檢查均于100 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。②供試品對(duì)照組：除不加入相應(yīng)控制菌，其余操作與試驗(yàn)組相同。③菌液對(duì)照組：除不加入供試液，其余操作與試驗(yàn)組相同。④陰性組：除不加入相應(yīng)控制菌及供試液，其余操作與試驗(yàn)組相同。

2 結(jié) 果

2.1 微生物計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均在0.5～2.0，滿足驗(yàn)證要求，見(jiàn)表1、表2。

2.2 控制菌檢查方法驗(yàn)證各制劑3 批樣品控制菌檢查驗(yàn)證結(jié)果顯示，試驗(yàn)組均可檢出銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌，且菌液對(duì)照組陽(yáng)性菌正常生長(zhǎng)，供試品對(duì)照組及陰性組均未檢出該兩種控制菌，驗(yàn)證結(jié)果滿足中國(guó)藥典要求。

表1 四種含抑菌成分外用制劑需氧菌總數(shù)的驗(yàn)證回收率

表2 四種含抑菌成分外用制劑霉菌和酵母菌總數(shù)的驗(yàn)證回收率

3 討 論

關(guān)于非無(wú)菌藥品的微生物限度檢查，2015年版的《中國(guó)藥典》［6］相較于2010年版的《中國(guó)藥典》［8］，無(wú)論在微生物計(jì)數(shù)部分還是控制菌檢查方面都進(jìn)行了培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、檢查方法等方面的調(diào)整，故而在進(jìn)行含抑菌成分制劑的微生物限度適用性方法的試驗(yàn)時(shí)，兩版藥典的驗(yàn)證結(jié)果也不一致。按2010年版的《中國(guó)藥典》所規(guī)定的驗(yàn)證方法僅需采用培養(yǎng)基稀釋法即可解決制劑抑菌性強(qiáng)的問(wèn)題，但當(dāng)按2015年版的《中國(guó)藥典》驗(yàn)證方法時(shí)，往往試驗(yàn)菌回收率達(dá)不到要求，需更換驗(yàn)證方法（如薄膜過(guò)濾法）或?qū)で蟾线m的供試品處理方法（如加入中和劑、滅活劑，增加稀釋液、培養(yǎng)基體積）才能滿足試驗(yàn)要求［6］。雖然部分制劑采用2015年版的《中國(guó)藥典》所規(guī)定的驗(yàn)證方法在操作性上存在一定的困難，但該版本所規(guī)定的培養(yǎng)基能滿足大多數(shù)需氧菌的生長(zhǎng)，有效提高污染菌的檢出率［9-10］，試驗(yàn)最后得出的驗(yàn)證方法不僅靈敏，而且更能保證廣大群眾的藥品安全。

本文所述的四種常用外用制劑多用于皮膚、黏膜消毒，皮膚瘙癢癥，皮炎等。此類(lèi)制劑通常含有較強(qiáng)的抑菌成分，如醋酸氯己定洗劑，所含的醋酸氯己定為陽(yáng)離子表面活性劑，有極強(qiáng)的廣譜抗菌、殺菌作用［11］；復(fù)方樟腦搽劑含樟腦、苯酚、薄荷腦、乙醇［11-13］；含酚爐甘石涂劑含苯酚［11］、爐甘石；復(fù)方硝酸咪康唑軟膏含鹽酸林可霉素（抗生素類(lèi)藥）、硝酸咪康唑（廣譜抗真菌類(lèi)藥）和醋酸地塞米松。故要求被試驗(yàn)供試品在有效去除自身抑菌作用下才能進(jìn)行污染菌限度的檢驗(yàn)，否則不能確保該制劑所污染的微生物被有效地檢出。

與此同時(shí)，醋酸氯己定洗劑及復(fù)方樟腦搽劑為均相溶液劑，能順利通過(guò)濾膜；含酚爐甘石涂劑為混懸劑，振搖后為均勻的粉紅色混懸液，且所含的氧化鋅及爐甘石不溶于水，采用薄膜過(guò)濾法時(shí)會(huì)出現(xiàn)堵膜的情況；而復(fù)方硝酸咪康唑軟膏為軟膏劑，其基質(zhì)尤為復(fù)雜，更加需要合適的處理方法才能解決過(guò)膜困難的問(wèn)題，故而針對(duì)不同類(lèi)型的制劑需根據(jù)各自特點(diǎn)采用不同驗(yàn)證方案。由于目前現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》刪除了離心法［6］，故本試驗(yàn)將供試品含酚爐甘石涂劑靜置后取上清液進(jìn)行試驗(yàn)，回收率良好。另一制劑復(fù)方硝酸咪康唑軟膏，因其復(fù)雜基質(zhì)及抗菌性［14］，本試驗(yàn)采用含10%聚山梨酯80 的pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液處理供試品后，靜置取水層液進(jìn)行試驗(yàn)［15］，結(jié)果亦滿足要求。

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，建立了適合于洗劑、搽劑、涂劑、軟膏劑四種不同類(lèi)型外用制劑的微生物限度檢查方法，試驗(yàn)所規(guī)定的驗(yàn)證菌回收率比值均在0.5～2 之間，控制菌試驗(yàn)滿足實(shí)驗(yàn)要求，為部分外用制劑在進(jìn)行微生物限度驗(yàn)證試驗(yàn)前提供了參考方法，同時(shí)為醫(yī)院制劑的質(zhì)量控制提供了可靠的檢測(cè)手段。