文/張蕭蕭，劉麗艷，黃寧，陳軍利（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室）

α2 腎上腺素受體（α2-adrenergic receptor, α2-AR）是GPCR 超家族的一種膜蛋白，是內(nèi)源性兒茶酚胺的受體，該受體有三種亞型，分別是α2A、α2B 和α2C[1-2]。α2-AR 可調(diào)節(jié)多種生理病理過程的發(fā)生發(fā)展，例如痛覺[3]、抑郁癥[4-5]、青光眼[6]、肝纖維化[7]等。因此，α2-AR 可能是治療上述疾病的重要靶點之一。多種以α2-AR 為靶點的藥物已經(jīng)上市并運用與臨床，如右旋美托咪定[5]、替托尼定[8]等。然而，目前以α2-AR為靶點的藥物存在許多問題，如對各亞型的選擇性差、副作用大等。因此，繼續(xù)研究新型以α2-AR 為靶點的藥物迫在眉睫。

近年來多項研究表明，別構(gòu)調(diào)節(jié)劑具有副作用小、選擇性高、耐藥率低且不影響受體生理功能等作用[9-10]。目前已有文獻(xiàn)報道過阿米洛利類化合物對α2-AR 具有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用[11]，但對α2B 和2C 的親和力及選擇性尚未見報道。本文檢測阿米洛利及Benzamil 對2B 和2C 的親和力，以探討這兩種化合物是否對α2-AR 受體亞型具有選擇性，為研發(fā)新型α2-AR 亞型選擇性藥物打下結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

COS-7 細(xì)胞（ATCC），PEI 40000（polysciences），PBS（HyClone），DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone），青霉素- 鏈霉素溶液（BioSharp），F(xiàn)BS（GIBCO），BCA 試劑盒（碧云天），3H-RX821002（PerkinElmer），酚妥拉明（Sigma），阿米洛利（MCE），Benzamil（MCE），15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿（NEST）。

1.2 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染及膜蛋白提取

將1×107個COS-7 細(xì)胞接種于20ml含有FBS 和雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基的15cm 培養(yǎng)皿中，在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染前1 小時，將培養(yǎng)液換為不含F(xiàn)BS 和雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基。將質(zhì)離DNA 與PEI40000 按1:3 混合，室溫靜置15 分鐘加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4-6 小時，將培養(yǎng)液換為含F(xiàn)BS 和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，48-72 小時后，提取膜蛋白。用10ml 4℃ PBS清洗細(xì)胞兩次，收集細(xì)胞于50ml 離心管中，離心（4℃，800g）5分鐘。用20ml HEPES 緩沖液重懸細(xì)胞，勻漿機24000r/min勻漿10秒，重復(fù)3次，每次間隔30秒。將重懸物離心（4℃，1300g）10分鐘，取上清離心（4℃，100000g）1小時，棄上清。用含10%甘油的HEM 緩沖液重懸沉淀，用1ml胰島素注射器反復(fù)吹打均勻，每管50μl 分裝，-80℃保存。BCA法檢測蛋白濃度。

1.3 受體表達(dá)實驗

將不同濃度含有目的蛋白（α2B 或α2C）的膜蛋白與2nM 的3H-RX821002室溫共孵育1 小時，非特異性結(jié)合為在100μM 酚妥拉明存在下的結(jié)合。加入4℃PBS 終止反應(yīng)，通過GF／B 濾膜過濾，最后用液體閃爍儀測定放射性。

1.4 競爭性結(jié)合實驗

將濃度依次增加（10-3M-10-10M）的阿米洛利或Benzamil 加入到含有α2B 或α2C-AR 的膜蛋白以及3.5nM 3H-RX821002 的HEM 緩沖液中，終體積為200μl，非特異性結(jié)合為100μM酚妥拉明存在下的結(jié)合。室溫孵育1 小時，加入4 ℃ PBS 終止反應(yīng)，GF ／ B濾膜過濾，通過液體閃爍儀對樣品放射性進(jìn)行測定。

圖1 α2B-AR（A）和α2C-AR（B）表達(dá)實驗A、B：Amiloride和Benzamil對α2B-AR的親和力；C、D：Amiloride和Benzamil對α2C-AR的親和力

圖2 阿米洛利類化合物對α2-AR的親和力檢測

2 結(jié)果

2.1 α2B-和α2C-AR 表達(dá)量檢測

通過表達(dá)實驗對每次所提取的膜蛋白的目的蛋白（α2B 或α2C-AR）進(jìn)行活性及表達(dá)水平檢測。如圖1A、1B 所示，配體受體總結(jié)合量隨著加入的膜蛋白量的增加而增加，非特異性結(jié)合變化不明顯，表明目的蛋白（α2B 或α2C-AR）表達(dá)量較高。對于α2B-AR（圖1A），我們選用4-8μg進(jìn)行后續(xù)的配體受體競爭性結(jié)合實驗；對于α2C-AR（圖1B），我們選取6-8μg 進(jìn)行后續(xù)的競爭性結(jié)合實驗。

2.2 阿米洛利類化合物與α2B-和α2CAR 親和力檢測

我們通過配體受體競爭性結(jié)合實驗檢測了阿米洛利和Benzamil 對α2B-AR 和α2C-AR 的親和力。如圖2 所示，阿米洛利對α2B-AR 和α2C-AR 的IC50 分別為30.73μM 和45.59μM；Benzamil 對α2B-AR 的IC50 為1.925μM， 對α2CAR 的IC50 為0.322μM，說明Benzamil 對α2C-AR 的親和力是α2B-AR 的6 倍，對α2C-AR 具有選擇性。

3 討論

α2-AR 是GPCR 超家族中的一種膜蛋白受體，有α2A、α2B 和α2C 三種受體類型參與了多種生理病理過程，例如痛覺、抑郁癥等。之前的文獻(xiàn)報道過阿米洛利類化合物對α2-AR 有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用，但是它們對α2B-AR 以及α2C-AC 的親和力以及選擇性尚未見報道，因此本文進(jìn)行了阿米洛利類化合物對其親和力的檢測。

我們發(fā)現(xiàn)Benzamil 對這兩個亞型的親和力均大于阿米洛利，且Benzamil 對不同受體類型的親和力也不同，即對α2CAR 的親和力是α2B-AR 的6 倍，可知，Benzamil 對α2C-AR 具有受體選擇性。該結(jié)果為研發(fā)新型α2C-AR 選擇性藥物打下一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。