朱旗，董藝超，張璐，馬旭＊ ，夏紅飛＊

（1．國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2．北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730）

早期胚胎停育，又稱稽留流產（missed abortion，MA），是孕早期胚胎停止發(fā)育或死亡、并滯留在宮腔內未自然排出的一種特殊情況的自然流產［1］。既往研究表明，許多危險因素參與了胚胎停育的發(fā)生，如胎兒的染色體異常，母體在孕早期受到物理、化學因素的不良影響，母體自身的健康狀況如感染、生殖器畸形、內分泌失調、自身免疫疾病等。然而，該疾病的發(fā)病機制目前尚未完全明確。

據報道，絨毛滋養(yǎng)層細胞出現異常，子宮內環(huán)境改造不足可以引發(fā)妊娠早期終止［2］。絨毛膜是由滋養(yǎng)層和胚外中胚層構成的膜，在胚胎植入過程中，滋養(yǎng)層細胞迅速增生并分化為內層的細胞滋養(yǎng)細胞和外層的合體滋養(yǎng)細胞。滋養(yǎng)層細胞有節(jié)制地侵入母體子宮蛻膜，對母體子宮蛻膜進行改造，以維持母胎界面的適度環(huán)境。妊娠早期，血管的生成和維持是胚胎發(fā)育以及胎盤形成的基礎。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是內皮細胞的特異性生長因子，可增加滋養(yǎng)層細胞的增殖、侵襲能力，在調節(jié)滋養(yǎng)層細胞侵入方面發(fā)揮重要作用［3－4］，已成為胚胎停育發(fā)病機制研究中的熱點。滋養(yǎng)層細胞表達細胞角蛋白19（cytokeratin－19or keratin－19，CK19）以及波形蛋白（Vimentin）［5－6］，通過觀察這兩種蛋白的表達來研究MA胎盤中的滋養(yǎng)層細胞和間質細胞組成，了解胎盤細胞的變化。細胞凋亡是個體發(fā)育過程中由基因編碼的細胞主動死亡過程，對調控機體發(fā)育、維護內環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。本研究擬通過檢測MA患者胎盤絨毛的VEGF、CK19和Vimentin表達以及細胞凋亡情況，來探討MA絨毛滋養(yǎng)層細胞的病理學變化，為臨床上MA的篩選、診斷及治療提供一定的理論基礎。

資料與方法

一、研究對象

選擇2011年12月至2013年12月于河北石家莊第六醫(yī)院門診就診的260例MA患者（孕周＜12周）作為研究對象，年齡19～46歲，孕8周前B超檢查提示胚胎發(fā)育良好，可見原始心管搏動，孕8～12周經臨床診斷為MA。選擇同期該院自愿行人工流產的正常早孕孕婦（孕周＜12周）作為對照組，共396例，年齡17～48歲，B超提示胚胎發(fā)育正常。

排除標準：服用緊急避孕藥物；生殖系統(tǒng)結構、內分泌、凝血功能異常；糖尿病、心血管疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺功能異常等其他全身性疾病病史；妊娠期疾病如高血壓、糖尿病等疾?。辉星捌诩霸衅诮佑|有毒有害物質；自身或者其配偶染色體異常；不良生活習慣如抽煙、酗酒、吸毒等；母兒血型不合、多胎妊娠等。

所有樣本均在征得患者知情同意下進行采集，其使用和處理均按國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所倫理委員會相關管理和監(jiān)督條例及標準進行，取得倫理委員會決議（2011第06號）同意。

取MA組及對照組患者的胎盤絨毛組織送至北京龍邁達科技公司制成組織陣列芯片，樣本按≤25歲、26～30歲、31～34歲、≥35歲年齡區(qū)間分組，每組隨機挑選10對（病例及對照）進行分析。

二、方法

1．免疫組化：免疫組化采用二步法染色，VEGF、CK19及Vimentin鼠抗人單克隆抗體均購自美國Santa Crutz公司，工作濃度1∶50。山羊抗小鼠IgG二抗（工作濃度1∶50）、DAB顯色試劑均購自北京中杉金橋公司，染色步驟按說明書進行，PBS代替一抗做陰性對照。使用H－score評分法對免疫組化陽性信號進行判定：H－score＝Σpi（i＋1），式中pi表示陽性細胞數量占切片中所有細胞數量的百分數，i代表著色強度［7］。每個樣本隨機挑選3個高倍視野（×400）進行觀察，應用ImageJ軟件中的IHC Profiler插件對每張圖片的陽性信號進行評分判定［8］，細胞內呈深棕黃色計為3分，呈現棕黃色計為2分，呈現淡黃色計為1分，均無著色計為0分。H－score得分越高，反映陽性結果表達量越高。

2．細胞凋亡檢測：采用Tunel檢測法，DeadEndTMColorimetric Apoptosis Detection System 試劑盒購自美國Promega公司，實驗流程嚴格按照說明書進行。將經過二甲苯脫蠟、無水乙醇水化的組織切片放到4%多聚甲醛中固定，用20μg／ml的蛋白酶K進行透化處理，再次固定之后使用平衡緩沖液平衡，隨后用生物素化的核酸混合液在37℃下標記60min，清洗之后用0．3%的 H2O2封閉，最后經DAB顯色，至淡棕色背景為止。用高壓消毒過的水代替rTdT酶設置陰性對照，陽性染色物胞核呈棕黃色。高倍鏡下隨機觀察3個視野（×400）計數陽性細胞，凋亡指數（apoptosis indexes，AI）＝陽性細胞數／細胞總數。

三、統(tǒng)計學分析

應用Graphpad Prism 7．0統(tǒng)計分析軟件對數據進行分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA分析。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、兩組絨毛滋養(yǎng)層細胞中VEGF表達水平比較

本研究檢測了MA組及對照組絨毛組織中VEGF的表達，發(fā)現MA組和對照組絨毛組織中均有VEGF表達，主要定位于滋養(yǎng)層細胞的細胞質及間質細胞中（圖1）。對陽性結果進行統(tǒng)計分析，MA組絨毛滋養(yǎng)層細胞中VEGF表達水平顯著低于對照組（P＜0．01）。≤25歲、26～30歲、31～34歲、≥35歲年齡分組中MA組的VEGF表達量均低于對照組，其中≥35歲分組中MA組與對照組有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）（表1）。

圖1 VEGF在正常早孕絨毛和MA絨毛組織中的表達（免疫組化，×400）

表1 對照組和MA組絨毛滋養(yǎng)層細胞VEGF表達水平比較（n＝10）

二、CK19和Vimentin在對照組和MA組絨毛組織中的表達變化

CK19反映滋養(yǎng)層細胞分布情況，Vimentin反映絨毛間質細胞的分布情況。本研究檢測了MA組及對照組中CK19和Vimentin的表達。結果顯示，MA組和對照組均可見CK19表達，主要分布于細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞中（圖2），且在MA組及對照組中的表達水平無顯著性差異（P＞0．05）（表2）；Vimentin在MA組及對照組中均有表達，主要位于間質細胞中，滋養(yǎng)層細胞偶有弱陽性表達（圖2），Vimentin在MA組中的表達水平略高于對照組，但兩組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）（表3）。

表2 對照組和MA組絨毛滋養(yǎng)層細胞CK19表達水平比較（n＝10）

表3 對照組和MA組絨毛滋養(yǎng)層細胞Vimentin表達水平比較（n＝10）

圖2 CK19和Vimentin在正常早孕絨毛和MA絨毛組織中的表達（免疫組化，×400）

三、MA患者絨毛滋養(yǎng)層細胞凋亡情況

為了了解MA患者及正常早孕絨毛滋養(yǎng)層細胞的凋亡情況，本研究利用Tunel法檢測了兩組絨毛組織中的細胞凋亡，結果顯示，對照組和MA組的絨毛滋養(yǎng)細胞，包括合體滋養(yǎng)細胞和細胞滋養(yǎng)細胞、間質細胞均可見細胞凋亡發(fā)生（圖3），MA組絨毛滋養(yǎng)層細胞的凋亡指數顯著高于對照組（P＜0．001）（表4）。

表4 對照組和MA組絨毛滋養(yǎng)層細胞凋亡指數的比較

圖3 Tunel法檢測細胞凋亡（×400）

討 論

一、胚胎停育胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞入侵情況

胎盤與母體相接觸的絨毛滋養(yǎng)層細胞是一種具有侵襲能力的內皮細胞。VEGF作為一種特異性血管內皮生長因子，可促進滋養(yǎng)細胞增殖、浸潤以及絨毛血管的形成，是調節(jié)胎盤血管生成和螺旋動脈重塑的重要因子［9－10］。VEGF異常表達可引起胚胎種植、胎盤形成等障礙，是造成自發(fā)流產的重要原因［11］。本研究通過檢測MA患者絨毛及正常早孕絨毛滋養(yǎng)層細胞中VEGF的表達水平，分析MA絨毛組織及正常早孕絨毛組織中的滋養(yǎng)層細胞侵入程度差異。結果顯示，MA滋養(yǎng)層細胞中的VEGF表達量相對較低，這與多項研究中自然流產胎盤組織的 VEGF表達水平較低這一結果［12－14］相一致，提示MA患者絨毛滋養(yǎng)層細胞VEGF的低表達與這一疾病的發(fā)生相關。由此推測，妊娠期滋養(yǎng)層細胞表達的VEGF特異性促進滋養(yǎng)層細胞的增殖及遷移，促進了滋養(yǎng)層細胞對子宮蛻膜的侵襲，而MA患者絨毛滋養(yǎng)層細胞的VEGF表達水平低下，導致滋養(yǎng)層細胞的增殖遷移能力異常，侵襲能力下降，對子宮內膜和肌層的侵入程度不足，未能形成充足的胎盤血管以維持胚胎的供血，最終導致MA發(fā)生。

二、滋養(yǎng)層細胞和絨毛間質細胞分布情況

細胞角蛋白Cytokeratin是一種發(fā)現于上皮細胞胞漿內的細胞骨架蛋白，起構建細胞纖維骨架并進一步參與細胞分化的作用［15］。CK19已經成為一種常見的腫瘤檢測標記物［16］，在腫瘤細胞中特異性表達。CK19是否也在MA過程中特異性表達，尚未有明確報道。波形蛋白Vimentin是一種Ⅲ型中間絲蛋白，表達于間充質細胞和部分外胚層細胞，在正常上皮細胞中不表達，是間葉組織來源細胞的標記。上皮細胞間質細胞轉化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是有極性的上皮細胞向可以在細胞基質間移動的間質細胞轉變的一個可逆過程，細胞滋養(yǎng)層細胞的遷移侵潤途徑類似于EMT過程［17］。本研究顯示正常早孕絨毛組織及MA患者絨毛組織中均有CK19以及Vimentin的表達，CK19主要分布于滋養(yǎng)層細胞中，而Vimentin主要表達于絨毛間質細胞中，MA組和對照組之間未見CK19及Vimentin的表達差異，提示MA發(fā)生過程中滋養(yǎng)層細胞和間質細胞分布沒有差異。這可能與早期妊娠中胎盤絨毛的侵襲轉移和融合這一動態(tài)EMT過程有關，在滋養(yǎng)層細胞發(fā)生侵襲轉移的開始會有一部分滋養(yǎng)層細胞丟失上皮細胞特征，轉變?yōu)殚g質細胞；而滋養(yǎng)層細胞發(fā)生融合時會分化出表現上皮細胞特性的新的合體滋養(yǎng)細胞，隨著細胞形態(tài)的動態(tài)改變，CK19和Vimentin表達量也處于不穩(wěn)定的變化過程中，推測由此造成了本研究中未觀察到MA組和對照組間CK19和Vimentin表達量的顯著性差異。

三、胎盤細胞凋亡情況

正常妊娠存在一定程度的滋養(yǎng)層細胞凋亡，過度凋亡會影響細胞侵襲及血管新生，進而影響胚胎植入和生長并造成流產［18－19］。本研究顯示在 MA患者絨毛及正常早孕絨毛滋養(yǎng)層細胞中均存在細胞凋亡，說明細胞凋亡參與妊娠胎盤絨毛的發(fā)育，調控胎盤絨毛組織結構的改建，抑制絨毛滋養(yǎng)層細胞對子宮的過度侵襲。對比兩組之間的凋亡指數，MA組絨毛滋養(yǎng)層細胞的凋亡情況較對照組嚴重，提示滋養(yǎng)層細胞凋亡異常與MA的發(fā)生密切相關。這一結果與目前許多文獻報道相符，推測滋養(yǎng)層細胞大量凋亡導致滋養(yǎng)層細胞的增殖與凋亡平衡打破，使絨毛生長受限、侵襲不足，從而阻礙孕卵發(fā)育，引發(fā) MA［20－22］。

綜上所述，本研究顯示VEGF在胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞中的低表達及絨毛滋養(yǎng)層細胞凋亡指數增加與MA發(fā)生密切相關，提示胎盤血管生成減少和滋養(yǎng)層細胞過度凋亡是造成MA的部分原因，為臨床上通過檢測患者絨毛組織的VEGF表達水平及細胞凋亡情況，有針對性的對患者進行監(jiān)護和治療，預防MA發(fā)生這一方案提供了一定的理論基礎。進一步研究引起VEGF低表達及細胞凋亡異常的分子作用機制，有助于解釋MA發(fā)生的具體原因，進而為預防和治療稽留流產找到解決方案。