李慧，廖碧翎，林小紅

（廣東省婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣州 510010）

習(xí)慣性流產(chǎn)（RPL）是指婦女與同一性伴侶發(fā)生連續(xù)3次以上的妊娠胚胎丟失。RPL發(fā)生率為1%～5%［1］，已成為臨床上最常見的不育癥之一；其治療難度大，給產(chǎn)婦和家庭帶來極大的身心傷害。RPL的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，可能的誘因包括子宮畸形、遺傳因素、免疫異常、感染等［2］。最新研究表明，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的母胎界面免疫異?？赡芘cRPL的發(fā)生有關(guān)［3］。妊娠狀態(tài)類似于同種異體移植過程［4］，母胎界面的免疫耐受使胚胎不被母體排斥；當(dāng)免疫耐受破壞后，母體對(duì)胚胎產(chǎn)生排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)。T淋巴細(xì)胞是一組來源于骨髓的多功能干細(xì)胞，按照表面CD抗原分為不同的亞群；其中CD3＋T細(xì)胞幾乎存在于所有T細(xì)胞表面，是成熟T細(xì)胞的主要標(biāo)記物［5］。研究表明，RPL患者外周血CD3＋細(xì)胞明顯高于正常孕婦，正常孕婦孕前CD3＋細(xì)胞水平升高是孕期流產(chǎn)的高危險(xiǎn)因素［6－7］。本研究通過分析RPL再次受孕患者和正常孕婦早孕期CD3＋細(xì)胞水平的差異，并隨訪妊娠結(jié)局，旨在評(píng)價(jià)CD3＋細(xì)胞對(duì)RPL患者不良妊娠的預(yù)測價(jià)值。

資料與方法

一、一般資料

選擇2017年12月至2018年10月就診于我院婦產(chǎn)科的RPL再次妊娠早孕期患者60例為研究對(duì)象，年齡20～36（28．5±3．9）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：本次受孕前發(fā)生3次以上自然流產(chǎn)的育齡婦女，患者及配偶間無染色體異常，患者性伴侶精液檢查正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：生殖道畸形，內(nèi)分泌疾病，血小板增多癥或血栓前狀態(tài)，自身免疫性疾病，全身或局部感染，陰道霉菌、衣原體、支原體或滴蟲陽性，異位妊娠，生化妊娠，妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病。

選擇同期于我院常規(guī)產(chǎn)檢的無既往自然流產(chǎn)史正常早孕婦女50例為對(duì)照組，年齡20～39（28．6±4．7）歲。研究對(duì)象均經(jīng)血HCG、B超檢查證實(shí)本次妊娠。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究前征得所有孕婦同意，并簽署知情同意書。

二、研究方法

1．研究試劑與儀器：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD3單克隆抗體、別藻藍(lán)蛋白（APC）標(biāo)記的小鼠抗人CD4單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的小鼠抗人CD8單克隆抗體均購自丹科醫(yī)療器械技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司；FACSAria II流式細(xì)胞儀（BD，美國）；溶血素、肝素抗凝管（BD，美國）。

2．樣本采集：兩組患者均于早孕期抽取新鮮外周血1ml，RPL組抽血時(shí)停經(jīng)時(shí)間39～68（53．6±5．6）d，對(duì)照組為39～74（54．6±7．5）d。血液樣本采集后置于肝素抗凝管，輕輕混勻3～5次，貼上相應(yīng)標(biāo)簽，常溫送檢。

3．流式細(xì)胞儀檢測外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T細(xì)胞數(shù)量：取50μl外周血，分別加入10μl FITC－CD3單克隆抗體、10μl APC－CD4單克隆抗體和10μl PE－CD8單克隆抗體，避光反應(yīng)20min。加入1ml溶血素，避光反應(yīng)20min，2 500rpm離心5min，棄去上清液。加入200μl磷酸鹽緩沖液輕輕振蕩混勻，2 500rpm離心5min，棄去上清液，載入加入200μl磷酸鹽緩沖液。利用流式細(xì)胞儀檢測CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T細(xì)胞數(shù)量，檢測操作參考儀器及試劑盒說明書。

4．資料收集與隨訪：記錄RPL組和對(duì)照組年齡、體重指數(shù)（BMI）、孕次、產(chǎn)次、停經(jīng)時(shí)間以及外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T細(xì)胞數(shù)量。隨訪孕婦妊娠結(jié)局，按照是否成功分娩分為RPL成功分娩組（24例）、RPL再次流產(chǎn)組（36例）和正常成功分娩組（48例），分析影響RPL再次流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19．0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析。采用Logistic回歸模型分析影響RPL患者不良妊娠的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。利用受試者工作曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）評(píng)價(jià)CD3＋T細(xì)胞對(duì)RPL患者不良妊娠的預(yù)測價(jià)值。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、隨訪結(jié)果

RPL組患者中24例成功分娩，36例再次流產(chǎn)；對(duì)照組1例失訪，1例自然流產(chǎn)，其余48例成功分娩。3組間年齡、BMI、產(chǎn)次、采血時(shí)停經(jīng)時(shí)間等一般資料比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），RPL再次流產(chǎn)組、RPL成功分娩組孕次顯著高于正常成功分娩組（P＜0．001）（表1）。

表1 各組一般資料比較（）

表1 各組一般資料比較（）

注：與正常成功分娩組比較，＊P＜0．001

組 別 例數(shù) 年齡 BMI（kg／m2） 孕次 產(chǎn)次 停經(jīng)時(shí)間（d）RPL再次流產(chǎn)組 24 28．1±3．9 21．44±2．33 3．22±0．42＊ 0．11±0．32 53．0±5．7 RPL成功分娩組 36 29．2±3．9 22．05±2．31 3．17±0．48＊ 0．13±0．34 54．5±5．4正常成功分娩組 48 28．7±4．8 21．12±1．84 0．19±0．39 0．19±0．39 54．8±7．6

二、3組孕婦外周血免疫細(xì)胞比值比較

RPL再次流產(chǎn)組外周血CD3＋和CD3＋CD4＋T細(xì)胞比值顯著高于RPL成功分娩組和正常成功分娩組（P＜0．05）；RPL成功分娩組外周血CD3＋T細(xì)胞比值顯著高于正常成功分娩組（P＜0．05），但兩組間CD3＋CD4＋T細(xì)胞比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；3組間CD3＋CD8＋T細(xì)胞比值相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（圖1、2）。

圖1 各組孕婦外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T細(xì)胞比值比較

圖2 孕婦CD3＋流式檢測散點(diǎn)圖

三、RPL再次流產(chǎn)危險(xiǎn)因素分析

單因素和多因素Logistic回歸分析顯示，CD3＋、CD3＋CD4＋T細(xì)胞是影響RPL患者再次流產(chǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0．05）（表2、3）。

四、CD3＋T細(xì)胞預(yù)測RPL患者再次流產(chǎn)的ROC曲線

CD3＋T細(xì)胞臨界值為79．02%時(shí)，預(yù)測RPL患者再次流產(chǎn)的AUC為0．836［95%CI（0．717，0．919）］，顯著高于CD3＋CD4＋T細(xì)胞［AUC＝0．630，95%CI（0．495，0．751）］（Z＝2．432，P＝0．015），對(duì)應(yīng)的特異性為91．7%，敏感性為63．9%（圖3）。

表2 RPL 再次流產(chǎn)危險(xiǎn)因素賦值

表3 RPL再次流產(chǎn)危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

圖3 CD3＋和CD3＋CD4＋T細(xì)胞預(yù)測RPL患者再次流產(chǎn)的ROC曲線

討 論

生理妊娠類似于同種異體移植，整個(gè)妊娠過程即是母體對(duì)胚胎免疫耐受的過程。正常情況下，胚胎作為同種異體移植物，可以存活至分娩結(jié)束。在妊娠的任何階段，母體自身免疫功能發(fā)生改變，會(huì)破壞母體和胚胎之間的免疫耐受平衡，導(dǎo)致胚胎移植失敗而發(fā)生流產(chǎn)［8］。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在機(jī)體體液免疫中發(fā)揮重要作用。研究表明，T淋巴細(xì)胞與生殖免疫有關(guān)，T淋巴細(xì)胞亞群的平衡對(duì)正常妊娠有著重要作用，一旦平衡被打破，即可引起母胎之間免疫失衡，最終導(dǎo)致妊娠失敗［9］。

T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的生殖免疫機(jī)制較為復(fù)雜，目前已知妊娠母體的胚胎基因有一半來自于父系；由于胚胎細(xì)胞表達(dá)了異體抗原，使母胎之間發(fā)生免疫排斥，因此母體需要發(fā)生免疫耐受才能避免胚胎被母體排斥，從而維持正常妊娠過程［10］。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)了由胚胎誘導(dǎo)的母胎天然免疫反應(yīng)，CD3＋幾乎表達(dá)于所有成熟T細(xì)胞表面，是T細(xì)胞的主要表面標(biāo)志。既往研究表明，CD3＋T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以直接影響滋養(yǎng)細(xì)胞的分化和增殖，從而影響胚胎的發(fā)育［11］。此外，CD3＋T細(xì)胞還可能通過血小板活化和血栓形成，誘發(fā)血栓性事件而導(dǎo)致妊娠失?。?2］。本研究顯示，無論是否成功分娩，RPL患者外周血CD3＋T細(xì)胞明顯高于正常成功分娩組，并且RPL再次流產(chǎn)組外周血CD3＋T細(xì)胞明顯高于RPL成功分娩組，提示CD3＋T細(xì)胞升高可能與RPL發(fā)生和RPL不良妊娠結(jié)局有關(guān)。

研究表明，伴胰島素抵抗的RPL患者外周血CD3＋和CD3＋CD4＋T細(xì)胞水平明顯升高，且CD4＋T細(xì)胞異常的患者更容易發(fā)生反復(fù)自然流產(chǎn)［12－13］。Wang等［14］稱孕婦CD4＋T細(xì)胞增多時(shí)，會(huì)增強(qiáng)母體對(duì)胚胎的免疫排斥反應(yīng)，而CD8＋T細(xì)胞會(huì)抑制CD4＋T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，因此CD4＋／CD8＋T比值穩(wěn)定對(duì)維持正常妊娠起著重要作用。Kwiatek等［15］研究顯示CD3＋CD4＋T細(xì)胞升高可以增強(qiáng)母體的免疫功能，導(dǎo)致母胎排斥反應(yīng)而誘發(fā)流產(chǎn)。在正常妊娠過程中，CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比值（Th／Ts）保持動(dòng)態(tài)平衡，從而維持正常妊娠［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，RPL再次流產(chǎn)組外周血CD3＋CD4＋T細(xì)胞明顯高于RPL成功分娩組和正常成功分娩組，但是3組CD3＋CD8＋T細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CD3＋CD4＋T細(xì)胞升高可能與RPL不良妊娠有關(guān)，而CD3＋CD8＋T細(xì)胞與RPL患者妊娠結(jié)局無關(guān)。目前關(guān)于CD3＋CD8＋T細(xì)胞對(duì)妊娠結(jié)局的影響爭議較大，梁仲城等［17］稱反復(fù)流產(chǎn)患者明確存在外周血中T細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4／CD8含量分布及T細(xì)胞CD4CD25異常表達(dá)。Grimstad等［18］則在研究中發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)和成功分娩的反復(fù)自然流產(chǎn)患者在妊娠早期CD3＋CD8＋無明顯變化。CD3＋CD8＋在RPL患者分娩結(jié)局中的作用仍需要進(jìn)一步研究。

本研究采用多因素回歸分析影響RPL患者再次流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示CD3＋、CD3＋CD4＋T細(xì)胞是影響RPL患者再次流產(chǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ROC分析顯示CD3＋T細(xì)胞預(yù)測RPL不良妊娠結(jié)局的AUC顯著高于CD3＋CD4＋T細(xì)胞（0．836vs．0．630），其臨界值為79．02%，說明妊娠早期CD3＋T細(xì)胞高于79．02%的RPL患者再次流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高。Talukdar等［19］報(bào)道稱孕婦妊娠前高CD3＋T細(xì)胞水平是妊娠后流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素。Du等［20］認(rèn)為無論妊娠結(jié)局如何，孕婦妊娠后外周血CD3＋T細(xì)胞明顯高于妊娠前，提示CD3＋T細(xì)胞與妊娠過程有關(guān)。本研究由于受試對(duì)象入選時(shí)間原因，未分析RPL患者妊娠前后血清CD3＋T細(xì)胞變化情況，在接下來的研究中我們也將在這方面做一些深入探討。

綜上所述，RPL患者再次妊娠早孕期檢測外周血CD3＋T細(xì)胞將有助于預(yù)測患者妊娠結(jié)局。