駱強(qiáng)翔，廖勇彬，黃昌平，郭江華，梁曉東

（江門市中心醫(yī)院／中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江門 529000）

無精子癥的人群發(fā)生率約為1%，占男性不育的10%～20%［1］。根據(jù)輸精管道是否通暢可分為梗阻性（obstructive aszoospermia，OA）和非梗阻性（non－obstructive aszoospermia，NOA）兩大類，后者約占60%［2］。睪丸活檢病理學(xué)診斷是明確患者睪丸中精子發(fā)生狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，有創(chuàng)操作不僅給患者造成痛苦，還可能對生精小管產(chǎn)生進(jìn)行性、不可逆性的破壞和結(jié)構(gòu)扭曲［3］。OA患者的睪丸生精功能正?；蚧菊?，可通過輸精管道復(fù)通或經(jīng)皮睪丸穿刺抽吸取精術(shù)（testicular sperm aspiration，TESA）獲得精子，獲精率幾乎達(dá)100%；而NOA患者睪丸生精功能往往不同程度受損，文獻(xiàn)報(bào)道穿刺獲精率僅為20%～50%左右［2］。精準(zhǔn)、無創(chuàng)的術(shù)前評估對提高TESA的獲精率、減少不必要的手術(shù)創(chuàng)傷、減輕患者的心理負(fù)擔(dān)意義重大。

睪丸體積間接的反應(yīng)了睪丸內(nèi)各級生精細(xì)胞、支持細(xì)胞的數(shù)量，精子的發(fā)生與成熟全過程則嚴(yán)格受控于下丘腦－垂體－睪丸軸的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，有賴于FSH、LH、T等性激素的協(xié)調(diào)作用。血清抑制素B（inhibin B，INHB）是由睪丸支持細(xì)胞特異性分泌的一種糖蛋白，其合成過程大部分在生精細(xì)胞內(nèi)完成，而后釋放到血液，是直接反映睪丸生精細(xì)胞功能狀態(tài)的血清學(xué)標(biāo)志物。簡言之，睪丸體積、血清INHB及性激素水平對NOA的病因、生精功能受損程度均有一定的提示作用，且具有無創(chuàng)性優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在探討以上指標(biāo)對預(yù)測NOA患者TESA獲精子結(jié)局的意義。

資料與方法

一、研究對象

實(shí)驗(yàn)組為2017年3月至2019年3月在中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心男科門診就診的162例接受TESA的NOA患者，按手術(shù)獲精子結(jié)局分為有精子組（TESA＋，n＝74）和無精子組（TESA－，n＝88）。入選標(biāo)準(zhǔn)：3次精液離心后鏡檢未見精子（3 000rpm，15min）；體格檢查及輔助檢查未見明確的輸精管道梗阻征象。排除標(biāo)準(zhǔn)：外周血染色體異常；Y染色體AZF基因a段或b段缺失；明確的生殖道外傷、感染史，或伴隨精索靜脈曲張。

正常組為60例同期精液常規(guī)參數(shù)正常者。

二、研究方法

1．睪丸體積：由B超測得，記錄穿刺側(cè)體積：若兩側(cè)睪丸大小、質(zhì)地相近，任選一側(cè)穿刺；否則選擇睪丸較大、質(zhì)地較好的一側(cè)穿刺。

2．血清INHB與性激素水平：患者晨起后7∶30～10∶00空腹在中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院檢驗(yàn)科抽血；INHB測定采用廣州康潤公司96TINHB定量檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）；性激素（FSH、LH、E2、PRL、T）測定采用美國西門子公司ADVIA Centaur XP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀并由其提供試劑盒；游離睪酮（fT）測定采用深圳新產(chǎn)業(yè)生物公司Maglumi 4000Plus全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測定儀并由其提供試劑盒。

3．常規(guī)TESA：實(shí)驗(yàn)組患者取截石位，會(huì)陰部消毒、鋪無菌巾，穿刺側(cè)精索阻滯麻醉。使用30ml注射器沿睪丸橫軸方向多個(gè)小角度反復(fù)進(jìn)針3～4次，負(fù)壓吸取約綠豆大睪丸組織分為兩份：其中一份用1ml注射器針頭充分撕碎后在400倍倒置顯微鏡下仔細(xì)尋找精子；另一份置于Bouin固定液中送病理檢查。所有的手術(shù)由同一位男科醫(yī)生完成，胚胎實(shí)驗(yàn)室顯微鏡檢或睪丸組織病理學(xué)檢查二者任一發(fā)現(xiàn)精子即入TESA＋組，否則入TESA－組。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18．0及 MedCalc18．2．1統(tǒng)計(jì)軟件處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。多均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較執(zhí)行SNK檢驗(yàn)和LSD檢驗(yàn)（方差齊性）或Dunnett’s T3檢驗(yàn)（方差不齊）；應(yīng)用ROC曲線對存在顯著性差異的指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)選，根據(jù)曲線下面積（Area Under Curve，AUC）來評價(jià)方法的優(yōu)劣，應(yīng)用Z統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)AUC的兩兩差異性，并采用Youden指數(shù)法確定最佳切點(diǎn)值及對應(yīng)的靈敏度和特異度。

結(jié) 果

一、各組間基礎(chǔ)資料比較

1．一般資料：各組間年齡、不育年限、體重指數(shù)（BMI）整體比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。

2．睪丸體積：TESA－組＜TESA＋組＜正常組，且組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。

3．INHB及性激素水平：TESA－組INHB水平顯著低于TESA＋組和正常組（P＜0．05），而TESA＋組與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；TESA－組E2水平顯著低于正常組（P＜0．05），其余組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；TESA－組FSH水平顯著高于TESA＋組和正常組（P＜0．05），而TESA＋組與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；TESA－組、TESA＋組LH、PRL水平顯著高于正常組（P＜0．05），而TESA－組與TESA＋組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）（表1）。

由此可見，睪丸體積、INHB、FSH三項(xiàng)指標(biāo)在TESA－組和TESA＋組間存在顯著性差異，推斷其對預(yù)測NOA患者TESA獲精子結(jié)局可能有意義。

表1 各組基礎(chǔ)資料比較（）

表1 各組基礎(chǔ)資料比較（）

注：與TESA＋組比較，＃P＜0．05；與正常組比較，＊P＜0．05

組 別 例數(shù) 年齡 不育年限 BMI（kg／m2） 睪丸體積（ml） INHB（pg／ml）TESA－組 88 30．74±4．90 4．52±3．29 20．68±2．54 7．19±4．42＃＊ 52．04±60．58＃＊TESA＋組 74 29．68±4．25 5．26±3．52 20．74±2．85 12．30±3．13＊ 128．33±64．34正常組 60 30．42±4．59 4．75±3．32 20．87±2．63 15．98±3．13 136．18±40．48組 別 例數(shù) LH（U／L） FSH（U／L） E2（pmol／L） PRL（nmol／L） T（nmol／L） fT（nmol／L）TESA－組 88 3．85±1．34＊ 11．65±8．46＃＊ 141．33±37．65＊ 0．36±0．23＊ 18．24±4．78 0．12±0．05 TESA＋組 74 4．12±1．27＊ 5．34±3．11 149．55±45．80 0．36±0．16＊ 17．09±6．00 0．11±0．05正常組 60 2．73±0．45 4．60±2．12 163．35±29．87 0．28±0．07 17．89±3．85 0．11±0．04

二、睪丸體積、血清INHB及FSH預(yù)測TESA獲精子結(jié)局的ROC曲線

繪制睪丸體積、血清INHB及FSH預(yù)測TESA獲精子結(jié)局的ROC曲線（圖1、圖2）。三者的ROC－AUC均大于0．7，表明以上指標(biāo)對預(yù)測NOA患者TESA獲精子結(jié)局有重要意義；三者的ROC－AUC由大至小排序?yàn)镮NHB＞睪丸體積＞FSH，應(yīng)用MedCalc18．2．1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，僅INHB與FSH的ROC－AUC有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），表明INHB的預(yù)測意義大于FSH，而INHB、FSH分別與睪丸體積比較預(yù)測意義無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）（表2）。

圖2 血清FSH的ROC曲線

圖1 睪丸體積及血清INHB的ROC曲線

表2 睪丸體積、血清INHB及FSH預(yù)測TESA獲精子結(jié)局的靈敏度和特異度

討 論

NOA的發(fā)生機(jī)制尚不明確，經(jīng)TESA獲精后ICSI助孕可使部分NOA患者獲得擁有遺傳學(xué)后代的機(jī)會(huì)，然而獲精子結(jié)局并不確切。本研究采用常規(guī)TESA術(shù)式，結(jié)果顯示NOA患者較高的血清INHB以及較低的FSH、較大的睪丸體積有利于TESA獲精，且INHB的預(yù)測意義優(yōu)于FSH。本研究結(jié)論與先前的一些研究相符：薈萃分析表明，根據(jù)睪丸體積和血清FSH水平可以預(yù)測睪丸生精功能是否存在障礙［4］；Madani等［5］認(rèn)為，對于睪丸體積較小、FSH水平較高的NOA患者，盲目行TESA檢查獲精率極低；Bonarriba等［6］發(fā)現(xiàn)NOA患者較低的INHB相比較高的FSH更容易導(dǎo)致TESA獲精失敗。睪丸體積預(yù)示著其內(nèi)部各級生精細(xì)胞的數(shù)量是否充足，而生精功能受下丘腦－垂體－睪丸軸的嚴(yán)格調(diào)控，下丘腦分泌GnRH作用于垂體前葉從而分泌FSH，后者作用于睪丸可促進(jìn)精母細(xì)胞逐步發(fā)育為成熟精子。值得注意的是，成年男性血清INHB由睪丸支持細(xì)胞特異性分泌，與FSH相比它是反映睪丸曲細(xì)精管生精狀態(tài)更加敏感的標(biāo)志物，被認(rèn)為是目前評價(jià)睪丸生精功能的最佳內(nèi)分泌標(biāo)志物［7］。

關(guān)于睪丸體積和血清FSH對NOA患者TESA獲精子結(jié)局的預(yù)測意義孰優(yōu)孰劣，目前尚存爭議。部分學(xué)者認(rèn)為睪丸體積的預(yù)測意義優(yōu)于血清FSH［8－9］，而另一些研究則持相反的觀點(diǎn)［10－12］。本研究認(rèn)為，盡管從數(shù)值上看睪丸體積的ROC－AUC要略大于血清FSH，但這種差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），表明二者的預(yù)測意義并無明顯的優(yōu)劣之分。本研究中的患者睪丸體積全部采用B超測量計(jì)算所得，相比傳統(tǒng)的睪丸體積測量器更具客觀性和準(zhǔn)確性，TESA未獲精子組的睪丸體積平均為7．19ml，顯著低于獲得精子組的12．30ml和正常組的15．98ml，表明睪丸體積與TESA獲精率呈正相關(guān)。國內(nèi)相關(guān)研究［10，13－14］采用了與本研究相同的術(shù)式，得出睪丸體積的切點(diǎn)值為8．3～9．0ml，與本研究8．15ml的結(jié)論類似，表明睪丸體積對預(yù)測NOA患者常規(guī)TESA的獲精率有良好的一致性與可靠性。Colpi等［15］總結(jié)138例NOA患者得出了與上述類似的結(jié)論，并認(rèn)為在同等條件下 Micro－TESA的獲精率較常規(guī)TESA高9．4%～11．1%。本研究相比Colpi等［15］更具針對性的Micro－TESA術(shù)式具有一定的隨機(jī)性與盲目性，同等條件下一般認(rèn)為獲精率要低于后者，亦低于“金標(biāo)準(zhǔn)”睪丸活檢術(shù)。

血清FSH水平可反映生精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞的分化和發(fā)育程度，高濃度的FSH往往預(yù)示著整個(gè)睪丸功能的損傷。研究表明，當(dāng)血清FSH＞7．61U／L時(shí)，可出現(xiàn)生精功能受損；達(dá)到12．31U／L時(shí)，可出現(xiàn)生精功能低下；而當(dāng)FSH＞17．63U／L時(shí)，TESA獲精率顯著降低［16－17］。本研究的FSH切點(diǎn)值為5．52U／L，較相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的8．20～13．31U／L［8－12］偏低，推測原因有三：（1）可能與血清FSH的分布特點(diǎn)有關(guān)。本單位血清FSH的參考值范圍為1．4～18．1U／L，本研究正常組60例樣本的FSH平均值為4．60U／L，第 25、50、75、95百分位數(shù)分別為3．14、4．27、5．33、9．10U／L，實(shí)驗(yàn)組162例樣本的FSH 平均值為8．77U／L，第25、50、75、95百分位數(shù)分別為4．22、6．19、10．79、25．39U／L，表明這兩組樣本的FSH均呈明顯的正偏態(tài)分布，即FSH在參考范圍的左側(cè)分布較多，從而導(dǎo)致FSH的切點(diǎn)值較低。（2）可能與手術(shù)方式的差異性有關(guān)。前述部分研究［8－11］采取了與本研究類似的常規(guī) TESA術(shù)式，也有研究［12］采取的是睪丸活檢。文獻(xiàn)報(bào)道，高濃度的血清FSH可能影響不到部分含有精子較少的生精小管［18］，相比常規(guī) TESA 而言，Micro－TESA術(shù)式或睪丸活檢術(shù)可以使外科醫(yī)生更大幾率地在睪丸中發(fā)現(xiàn)這些生精小管，從而有望成功獲取精子［19］。本研究相對較低的獲精率可能導(dǎo)致FSH的切點(diǎn)值較低。（3）不同術(shù)式的研究結(jié)論差異較大，而即便是類似的術(shù)式，得出的結(jié)論亦差異較大，推測可能還與各研究者的樣本量、入選標(biāo)準(zhǔn)以及術(shù)者經(jīng)驗(yàn)均有一定的關(guān)系，同時(shí)一定程度上也反映出該指標(biāo)具有不確定性。

目前，國內(nèi)外關(guān)于血清INHB的相關(guān)研究尚為數(shù)不多，但多項(xiàng)研究認(rèn)為血清INHB的預(yù)測意義優(yōu)于血清 FSH［6，14，20－21］，與本研究結(jié)論 一致。睪丸支持細(xì)胞對生精細(xì)胞的分化成熟起著至關(guān)重要的機(jī)械支持、屏障保護(hù)與營養(yǎng)作用，成年男性血清INHB全部來自于睪丸支持細(xì)胞的分泌，具有高度的特異性。與FSH不同的是，它的血清濃度不受GnRH、雌／雄激素等因素的影響［7］，因此比FSH更能體現(xiàn)睪丸的生精狀態(tài)。本研究血清INHB的切點(diǎn)值為70．15pg／ml，與 相 關(guān) 研 究 報(bào) 道 的 23．35pg／ml、40pg／ml有差異［14，22］，而與 Bonarriba等［6］報(bào)道的67pg／ml近似。前者采用睪丸活檢術(shù)，睪丸活檢病理學(xué)作為評判睪丸生精功能的 “金標(biāo)準(zhǔn)”，獲精陽性率更高，故INHB的切點(diǎn)值可能比本研究所采取的常規(guī)TESA術(shù)式低；而后兩者則是采用與本研究類似的常規(guī)TESA。研究結(jié)論有同有異，表明有待更大樣本的、更多中心的研究或薈萃分析來充實(shí)或修正這一結(jié)論。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)的預(yù)測意義與其對應(yīng)的靈敏度和特異度并不成正比（表2），表明單一的預(yù)測指標(biāo)無絕對的優(yōu)勢性，聯(lián)合診斷意義重大。

本研究NOA患者總例數(shù)僅為162例，較低的樣本量可能降低本研究結(jié)論的可靠性，有待更長時(shí)間的臨床實(shí)踐以擴(kuò)大樣本量；其次，如前所述，本研究采取的常規(guī)TESA術(shù)式獲精陽性率較Micro－TESA及“金標(biāo)準(zhǔn)”睪丸活檢術(shù)偏低，具有一定的局限性，從而可導(dǎo)致結(jié)果偏倚，表現(xiàn)為FSH切點(diǎn)值可能偏低，而睪丸體積和INHB的切點(diǎn)值可能偏高。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，睪丸組織的病理分型與NOA患者的精子獲取率及ICSI受精率密切相關(guān)，其中精子發(fā)生低下型的精子獲取率及ICSI受精率要明顯高于精子成熟阻滯型和唯支持細(xì)胞型［23－24］。作為本研究的延伸，未來我們將在進(jìn)一步豐富樣本量的基礎(chǔ)上，綜合睪丸體積、血清INHB及FSH三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行Logistic回歸分析，根據(jù)預(yù)測概率描繪ROC曲線用于聯(lián)合預(yù)測TESA獲精率及睪丸病理類型，從而進(jìn)一步指導(dǎo)臨床工作。