宋樹森 李強 谷海峰 王巖 沈陽市第六人民醫(yī)院 （遼寧 沈陽 110006）

內(nèi)容提要：目的：觀察PCR儀與測序儀在丙型肝炎病毒（HCV）基因型檢測中的應(yīng)用。方法：選擇2018年1月～2018年12月收治的134例HCV感染患者為研究對象，給予患者PCR儀檢測、測序儀檢測。結(jié)果：測序儀檢測134例均可分型，PCR儀檢測130例患者可分型，4例未能分型。PCR檢測結(jié)果：134例HCV感染患者中，1b型59例，2a型47例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，4例為分出型別?；驕y序結(jié)果：134例均可分型：1型59例，2a型40例，2i型7例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，6n型4例。PCR儀檢測法檢測符合率97.0%。結(jié)論：PCR儀測序儀檢測用于丙型肝炎病毒基因型檢測，操作便捷，但其只能檢測探針覆蓋的型別，個別罕見型別不能分型。

作為慢性肝病的主要病因之一，HCV感染的危害已經(jīng)引起了人們的廣泛重視[1]。HCV基因型檢測是臨床控制HCV感染的基礎(chǔ)[2]。由于不同基因亞型病毒感染引發(fā)的臨床表現(xiàn)各異，治療方案亦有所差別。因此，需要通過對HCV感染患者的精確基因型檢測，為其臨床治療提供良好的支持。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

納入2018年1月～2018年12月本院收治的134例HCV感染患者為研究對象。其中，男86例，女58例；年齡（36.9±12.5）歲。

儀器與試劑：實時熒光PCR儀（ABi 7500），測序儀（ABi 3130基因測序儀），丙型肝炎病毒（HCV）基因分型檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）由泰普生物科學（中國）有限公司提供，丙型肝炎病毒（HCV）基因分型檢測試劑盒（DNA測序法）北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司提供，HCVRNA提取試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，德國Qiagen公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測

①取樣。取118例HCV感染患者2mL空腹靜脈血，以3000r/min速度，持續(xù)離心處理10min，獲得血清標本，置于-80°C溫度冰箱內(nèi)保存。②核酸提取。血清樣本按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說明書進行核酸提取純化。③PCR檢測。分別取各亞型HCV RT-PCR反應(yīng)液38×（n+2）μL和酶系2×（n+2）μL，（n等于首檢樣本數(shù)），混勻，各管分別按40μL/管分裝到PCR反反管中。再在各亞型HCV RT-CR反應(yīng)液中分別加入25μL礦物油。HCV RNA或質(zhì)控品的提取產(chǎn)物各10μL。混勻，放入PCR儀，按下列程序條件擴增：42°C 30min；95°C 3min；再按94°C 20S→55°C 20S→72°C 30S，循環(huán)10次；再按94°C 15S→60°C 45S，循環(huán)30次。④結(jié)果判讀。如果檢測樣本無典型S擴增曲線或Ct值＞26.5，則判樣本為HCV 1b、2a、3a、3b和6a陰性；如果檢測樣本呈典型S曲線且Ct值≤25.1，則根據(jù)說明書提供的表格判斷樣本的亞型。

1.2.2 測序檢測

①HCV-RNA標本制備。選擇德國Qiagen QIAamp病毒RNA抽提試劑盒從HCV感染患者的200μL血清標本中提取HCV病毒RNA，將病毒RNA置于-80°C環(huán)境下保存待檢。②基因擴增。選擇HCV 感染患者的HCV NS5B 基因區(qū)域作為測序重點，擴增方法選擇反轉(zhuǎn)錄方法。擴增完畢通過擴增曲線判斷是否擴增成功。將擴增成功的片段純化，然后進行測序反應(yīng)，產(chǎn)物再次純化后準備上級。③測序。將純化產(chǎn)物加入96孔板，過夜檢測。④分析。將測序片段提交到NCBI網(wǎng)站進行基因分型分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）。

1.3 觀察指標

統(tǒng)計兩種檢測方法的基因型檢測結(jié)果；對比兩種檢測方法的檢測符合率。

1.4 統(tǒng)計學分析

以SPSS23.0軟件統(tǒng)計。P＜0.05，差異顯著。

2.結(jié)果

2.1 基因型檢測結(jié)果

測序儀檢測134例患者均可分型，而PCR檢測130例可分型，另外4例患者未能分型。

測序檢測結(jié)果：134例HCV感染患者中：1型共77例，1型59 例，2a型40 例，2i型7 例，3a型6 例，3b 型15 例，6a型3例，6n型4例。HCV基因型主要為1b型和2a型，二者占比之和達73.9%。其中2i型和6n型為PCR法檢測不到的。

PCR檢測結(jié)果：134例HCV感染患者中，1b型59例，2a型47例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，4例為分出型別。同樣以1b型和2a型為主。

2.2 檢測符合率

以本組134例HCV感染患者的基因型一代測序檢測結(jié)果為金標準，評估PCR儀檢測的符合率，結(jié)果提示：PCR儀檢測法對HCV感染患者基因型的檢測符合率為97.0%（130/134）。

3.討論

隨著臨床關(guān)于HCV感染研究的不斷深入，HCV基因型檢測已經(jīng)成為這一領(lǐng)域研究的主要方向之一[3]。不同的基因型，所應(yīng)用的治療手段與治療周期都是不同的。目前可用于HCV基因型檢測的方法較多，如異源分子遷移率分析法、測序法、PCR分析法，斑點雜交法等[4]。其中，測序法是臨床開展HCV基因分型的金標準。這種檢測方法可保障HCV感染患者的基因型檢測結(jié)果的準確性，但其存在耗時較長、檢測過程繁瑣等不足[5]。

相對于其他檢測技術(shù)而言，PCR技術(shù)是一種具有典型高效性、便捷性特征的檢測方法。將其用于HCV感染患者的基因型檢測，可于檢測2～3h內(nèi)獲取檢測結(jié)果。雖然這種檢測方法的靈敏度水平較高，但由于引物的限制，其在區(qū)分部分罕見HCV的基因時，可能會出現(xiàn)檢測失敗。同時，對于2a型和2i型不能分辨，但由于這兩種基因型生物學特性較一致，所以可以忽略。此外，本研究證實：PCR檢測HCV感染基因型的符合率為97.0%。這一結(jié)果提示：這種檢測方法在基因分型準確性方面良好。

綜上所述，相對于測序儀檢測而言，PCR儀在HCV基因型檢測便捷性方面具有明顯優(yōu)勢，且這種檢測方法的符合率良好。因此，在HCV感染患者的基因型檢測中，可將PCR儀檢測結(jié)果作為參考。