張偉理永霞劉振凱高夢鴿孟繁麗張星耀

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091；2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210037）

松材線蟲?。≒ine wilt disease）即松樹萎蔫病，是以松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus為病原[1]，墨天牛屬昆蟲Monochamusspp.為主要媒介[2]，綜合人為參與、寄主松樹、相關(guān)伴生菌和環(huán)境因素互作的一種復(fù)雜病害系統(tǒng)[3-4]。該病于20 世紀(jì)80 年代初傳入我國境內(nèi)，隨后迅速擴(kuò)散蔓延。根據(jù)國家林業(yè)局公告（2019 年第 4 號），2019 年我國大陸地區(qū)松材線蟲發(fā)病區(qū)已經(jīng)擴(kuò)張至18 個省市自治區(qū)的531 個區(qū)縣，對我國松林生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。松材線蟲的生活史可分為繁殖型周期和擴(kuò)散型周期[2，5]。在適宜的環(huán)境下，松材線蟲進(jìn)入繁殖型周期（egg、L1、L2、L3、L4和 adult），種群數(shù)量不斷增加，造成松樹發(fā)病死亡。在不良環(huán)境條件下，松材線蟲進(jìn)入擴(kuò)散型周期即滯育型周期，包括擴(kuò)散型三齡幼蟲（DL3）和擴(kuò)散型四齡幼蟲（Dauer，DL4）兩個階段[6]。當(dāng)松墨天牛Monochamus alternatus的蛹羽化為成蟲時，擴(kuò)散型三齡幼蟲被誘導(dǎo)形成擴(kuò)散型四齡幼蟲，進(jìn)入松墨天牛體內(nèi)[7-9]。擴(kuò)散型四齡幼蟲口針退化不取食，依靠消耗體內(nèi)能量運(yùn)動[8]。天牛成蟲羽化后取食健康松樹時，擴(kuò)散型四齡幼蟲轉(zhuǎn)移至健康松樹，并在松樹體內(nèi)適宜的環(huán)境條件下解除滯育，轉(zhuǎn)型并發(fā)育為成蟲，進(jìn)入繁殖周期開始大量繁殖危害松樹[10]。因此，松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲的轉(zhuǎn)型是其完成危害松樹生活史的重要環(huán)節(jié)。

松材線蟲在擴(kuò)散型四齡幼蟲階段完成了從病死松樹進(jìn)入天牛成蟲以及從天牛成蟲進(jìn)入健康松樹的傳播過程[8]。目前對于松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲的研究表明，松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲與繁殖型幼蟲相比較會發(fā)生生理和結(jié)構(gòu)上的特異性變化，例如松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲的表皮增厚、生殖腺發(fā)育停滯、脂滴增加、口針退化等以利于度過不良環(huán)境[8，11-12]。松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲是擴(kuò)散型三齡幼蟲在天牛分泌的脂肪酸乙酯促進(jìn)下發(fā)育形成的，并且發(fā)現(xiàn)松材線蟲Insulin 信號通路的daf-16和 daf-12 基因上調(diào)表達(dá)參與此過程[8，13]。而擴(kuò)散型四齡松材線蟲能夠受到天牛分泌的蛔甙（ascarosides）吸引從而進(jìn)入天牛，伴隨天牛取食健康松樹進(jìn)行傳播[9]。松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲除了可以受到天牛的吸引以外，還可以受到松樹化學(xué)物質(zhì)的吸引，在傳播媒介天牛取食健康松樹的新鮮樹葉過程中轉(zhuǎn)移至健康松樹中[14]。松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲在接觸松樹之后，如黑松Pinus thunbergii、赤松Pinus densiflora、五針?biāo)蒔inus parviflora、落葉松Larix leptolepis和雪松Cedrus deodara等，均可以促進(jìn)松材線蟲向成蟲的轉(zhuǎn)型，而無松樹刺激則轉(zhuǎn)型不明顯[6]。另外，研究表明松樹揮發(fā)物單萜類α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、β-月桂烯和檸檬烯均可以促進(jìn)松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲的轉(zhuǎn)型[15]。然而，目前關(guān)于松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲轉(zhuǎn)型過程的研究尚不多見，其他樹種對于松材線蟲轉(zhuǎn)型的影響也未見報道。

綜上所述，筆者以松材線蟲病防治關(guān)鍵齡期擴(kuò)散型四齡幼蟲為研究對象，通過光學(xué)顯微鏡觀察了松材線蟲DL4 轉(zhuǎn)型的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化過程，以及油紅染色后的脂肪特征變化，分析了松科植物對于轉(zhuǎn)型過程的影響，為闡明松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲轉(zhuǎn)型的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為松材線蟲病的科學(xué)防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 擴(kuò)散型四齡松材線蟲收集 解剖松墨天牛獲得擴(kuò)散型四齡松材線蟲。為了保證擴(kuò)散型四齡松材線蟲的蟲態(tài)一致性，于4—8 月天牛羽化高峰期，在浙江和廣東等省松材線蟲病發(fā)生區(qū)的松林中懸掛誘捕器（杭州費(fèi)洛蒙生物科技有限公司），收集松墨天牛，將松墨天牛肢解在含有無菌水的培養(yǎng)皿中，放置2 h。待松材線蟲從松墨天牛氣管中游出后，用移液器吸出移至新的無菌水培養(yǎng)皿中。將收集到的擴(kuò)散型四齡松材線蟲放入4 ℃冰箱待用。

1.2 擴(kuò)散型四齡松材線蟲轉(zhuǎn)型過程形態(tài)觀察 在直徑35 mm 培養(yǎng)皿中，加入4 mL 無菌水，放置1 塊5 mm×5 mm 的馬尾松木片作為誘導(dǎo)物，加入100頭擴(kuò)散型四齡松材線蟲。每隔12 h 觀察1 次線蟲狀態(tài)，并拍照（CZX51 and BX51，Olympus，Japan）。

1.3 擴(kuò)散型四齡松材線蟲轉(zhuǎn)型過程油紅染色 采用油紅對轉(zhuǎn)型過程中的擴(kuò)散型四齡松材線蟲進(jìn)行染色。配制0.01 g/mL 的油紅溶液（Sigma，USA），溶劑為乙醇，配制完成后震蕩混勻2 min，經(jīng)過0.22 μm的過濾器過濾，保存于4 ℃冰箱待用。使用時，將配制完成的油紅溶液再次過濾，室溫放置10 min，取100 μL于1.5 mL 離心管中，加入等體積的上述不同轉(zhuǎn)型時期的松材線蟲，染色12 ～16 h 后，將線蟲置于水中，挑取相應(yīng)轉(zhuǎn)型時期線蟲觀察、拍照。

1.4 多種松科植物對擴(kuò)散型四齡松材線蟲轉(zhuǎn)型的影響 在天牛羽化高峰期選擇銀杏Ginkgo biloba、紅豆杉Taxus chinensis、圓柏 Sabina chinensis、側(cè)柏Platycladus orientalis、雪松 Cedrus atlantica、油松Pinus tabuliformis、黑松和馬尾松 P.massoniana 的枝條，測試不同植物對于松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲轉(zhuǎn)型的影響。在35 mm 培養(yǎng)皿中，加入4 mL 無菌水，放置1 塊5 mm ×5 mm 的植物枝條作為誘導(dǎo)物，對照未加任何植物枝條，加入30 頭擴(kuò)散型四齡松材線蟲，2 d 后觀察轉(zhuǎn)型為成蟲的數(shù)量，并計算轉(zhuǎn)型率。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 18.0 中的單因素方差分析對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)散型四齡松材線蟲向成蟲轉(zhuǎn)型過程形態(tài)

在馬尾松木片誘導(dǎo)下，松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲可在36 ～48 h 完成轉(zhuǎn)型。整個轉(zhuǎn)型過程可劃分為5個階段，包括擴(kuò)散型四齡（DL4）、轉(zhuǎn)型前期（TP）、轉(zhuǎn)型中期（TM）、轉(zhuǎn)型后期（TA）和轉(zhuǎn)型末期（TT）。松材線蟲DL4 階段，頭部鈍圓，無溢縮，尾巴尖，無性別特征；TP 階段，線蟲呈現(xiàn)豎直狀態(tài)，輕微擺動，可見頭部蛻皮，出現(xiàn)口溢縮，尾部膨大；TM 階段，蛻皮明顯，線蟲開始彎曲，出現(xiàn)性別特征，但是不顯著；TA 階段，進(jìn)一步完成蛻皮，線蟲成蟲狀態(tài)表現(xiàn)明顯，雌蟲出現(xiàn)陰門蓋，雄蟲出現(xiàn)交合刺；TT 階段完成蛻皮（圖1）。

圖1 松材線蟲擴(kuò)散型四齡向成蟲轉(zhuǎn)型過程顯微鏡觀察Fig.1 Transformation process of B.xylophilus DL4 observed by microscope

2.2 擴(kuò)散型四齡松材線蟲向成蟲轉(zhuǎn)型過程脂肪染色觀察 DL4 階段脂肪多且密集，染色較深，說明整體含量很高；頭部顏色較淺，脂肪含量較少，腹部和尾部顏色較重，脂肪含量較高。TP 階段脂肪含量迅速下降，僅有頭部、尾部有區(qū)域化脂肪染色，但無明顯顆粒感，而腹部和體壁內(nèi)側(cè)仍然存在少量的脂肪。TM 階段，頭部脂肪顆粒消失，腹部體壁內(nèi)側(cè)和尾部仍有少量脂肪存在。TA 階段，雌蟲頭部脂肪顆粒消失，其他部位均有脂肪存在；而雄蟲頭部和尾部均無脂肪顆粒染色，僅有蟲體中間部分有脂肪存在。TT 階段與TA 階段相似，但是TT 階段松材線蟲表現(xiàn)出明顯的脂肪顆粒感，且頭部出現(xiàn)較弱的個別脂肪顆粒（圖2）。另外，松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲有一部分不能完成轉(zhuǎn)型，形態(tài)上依然保持DL4 階段形態(tài)，但是體內(nèi)脂肪顆粒大量減少，被消耗殆盡（圖2，DL4 UT）。

圖2 松材線蟲擴(kuò)散型四齡向成蟲轉(zhuǎn)型過程脂肪染色顯微鏡觀察Fig.2 Lipid status during transformation process of B. xylophilus DL4 observed by microscope

2.3 多種松科植物對擴(kuò)散型四齡松材線蟲轉(zhuǎn)型的影響 非松科植物銀杏對松材線蟲轉(zhuǎn)型沒有影響，與空白對照組接近，松材線蟲轉(zhuǎn)型率約為13%。松科植物對松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲轉(zhuǎn)型均有顯著的促進(jìn)作用，紅豆杉和雪松促進(jìn)下松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲的轉(zhuǎn)型率約為30%，而圓柏、側(cè)柏和油松促進(jìn)轉(zhuǎn)型更為明顯，在其刺激下，松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲的轉(zhuǎn)型率約為55%，促進(jìn)效果最為顯著的為黑松和馬尾松，在其刺激下，松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲轉(zhuǎn)型的轉(zhuǎn)型率達(dá)到了80%以上。測試的松科植物中，雪松、油松、黑松和馬尾松為已知的松材線蟲寄主（圖3）。

圖3 多種松科植物對擴(kuò)散型四齡松材線蟲轉(zhuǎn)型的促進(jìn)作用Fig.3 Promotion of Pinidae trees to B.xylophilus DL4 transformation

3 結(jié)論與討論

松材線蟲由擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲轉(zhuǎn)型是其危害松樹的關(guān)鍵步驟，筆者觀察并定義了松材線蟲轉(zhuǎn)型過程的5 個階段，分別為DL4、轉(zhuǎn)型前期（TP）、轉(zhuǎn)型中期（TM）、轉(zhuǎn)型后期（TA）和轉(zhuǎn)型末期（TT）。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)型過程中脂肪含量在DL4 階段含量很高，但是在TP 階段即發(fā)生了大部分的轉(zhuǎn)化，而后各個階段脂肪含量相對較少。選用的松科植物紅豆杉、圓柏、側(cè)柏、雪松、油松、黑松和馬尾松均促進(jìn)DL4 的轉(zhuǎn)型且效果明顯，其中以黑松和馬尾松木塊刺激下松材線蟲轉(zhuǎn)型率最高，而非松科植物銀杏無轉(zhuǎn)型促進(jìn)效果。該研究為進(jìn)一步探明松材線蟲由擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲轉(zhuǎn)型的分子及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時也為松材線蟲的科學(xué)防治提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

前人僅對松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲與成蟲進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲的表皮增厚、生殖腺發(fā)育停滯、脂滴增加、口針退化等以利于度過不良環(huán)境，并未對線蟲轉(zhuǎn)型的動態(tài)過程進(jìn)行深入研究[8，11-12]。筆者以松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲為研究對象，通過光學(xué)顯微鏡觀察了松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲轉(zhuǎn)型的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，更加深入了解其變化過程。

與繁殖型幼蟲相比，擴(kuò)散型幼蟲的體內(nèi)脂肪含量會增加，以利于其抵抗干燥、高溫或者食物短缺等不良環(huán)境[16-18]。例如秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans 當(dāng)環(huán)境不利時，如食物缺乏、種群密度增加、溫度升高等，C.elegans 形成類似于松材線蟲擴(kuò)散型的dauer 幼蟲[16]。該階段C.elegans 幼蟲進(jìn)入滯育期，不再進(jìn)食且身體結(jié)構(gòu)特化，如身體輻射狀縊縮、口被內(nèi)部形成的栓所封閉、表皮形成特化的脊、體內(nèi)脂肪粒增多等，可以抵御不良外界環(huán)境。當(dāng)外界環(huán)境恢復(fù)有利條件時，如充足的食物、稀疏的種群密度和溫和的溫度等，dauer 幼蟲會轉(zhuǎn)型進(jìn)入繁殖周期。松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲與繁殖型相比較，其腸道和皮下存在大量脂滴，其中包含一些高電子密度物質(zhì)[11]，我們的研究也表明DL4 階段含有大量脂肪。另外，松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲有一部分不能完成轉(zhuǎn)型，形態(tài)上依然保持DL4 階段形態(tài)，但是體內(nèi)脂肪顆粒大量減少，被消耗殆盡。這些不轉(zhuǎn)型的擴(kuò)散型松材線蟲可能未接收到轉(zhuǎn)型啟動信號不能轉(zhuǎn)型，但是線蟲一直處于運(yùn)動狀態(tài)，需要不斷消耗脂肪維持能量供給，因此脂肪被消耗掉。

在不同松科植物刺激條件下，松材線蟲能夠迅速完成轉(zhuǎn)型，發(fā)育為成蟲。非松科植物銀杏對松材線蟲轉(zhuǎn)型沒有影響，而松科植物對松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲轉(zhuǎn)型均有顯著的促進(jìn)作用，其中以黑松和馬尾松促進(jìn)效果最為顯著。前人研究也表明松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲在接觸松樹之后，黑松、赤松、五針?biāo)?、落葉松和雪松等均可以促進(jìn)松材線蟲向成蟲的轉(zhuǎn)型，而無松樹刺激則轉(zhuǎn)型不明顯[6]。另外，松樹揮發(fā)物單萜類α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、β-月桂烯和檸檬烯均可以促進(jìn)松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲的轉(zhuǎn)型[15]。由此，可以推測松科植物促進(jìn)松材線蟲擴(kuò)散性四齡幼蟲轉(zhuǎn)型與其含有的萜烯類物質(zhì)有關(guān)。

萜烯類物質(zhì)促進(jìn)松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲轉(zhuǎn)型，其機(jī)理目前尚不清楚。在 C.elegans 的dauer 轉(zhuǎn)型過程中，當(dāng)遇到環(huán)境信號（食物、溫度和密度等）刺激時，細(xì)胞膜上的G-蛋白偶聯(lián)化感受體與配體化學(xué)分子結(jié)合，啟動鳥苷酸環(huán)化酶途徑，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷鳥嘌呤核苷（cGMP）濃度升高，激活cGMP-門控離子通道，將胞外信號傳遞進(jìn)入胞內(nèi)，激活 Insulin 和 TGF- β 通路的信號分子[19]。這些信號分子在內(nèi)分泌細(xì)胞表面與各自受體結(jié)合，分別啟動相應(yīng)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。最終兩條信號通路共同調(diào)控daf-9 的表達(dá)，產(chǎn)生的DA 與靶組織DAF-12 結(jié)合后，促進(jìn)繁殖發(fā)育，抑制dauer 形成。相反，當(dāng)DA 含量下降時，空載核受體DAF-12則促進(jìn)dauer 形成，抑制繁殖發(fā)育[20]。研究表明，松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲是由擴(kuò)散型三齡幼蟲在天牛分泌的脂肪酸乙酯的促進(jìn)下發(fā)育形成的，并且發(fā)現(xiàn)松材線蟲Insulin 信號通路的daf-16 和daf-12 基因上調(diào)表達(dá)參與此過程[8，13]。因此，C.elegans 的dauer 形成因素及基因表達(dá)調(diào)控為進(jìn)一步研究松材線蟲擴(kuò)散型四齡幼蟲向成蟲轉(zhuǎn)型的機(jī)制提供了良好的理論基礎(chǔ)，也為松材線蟲的科學(xué)防治提供新的思路。