呂孟轅彭騁張東劉洪明何邦令劉會香

（1.山東農業(yè)大學植物保護學院/山東省林業(yè)有害生物防控工程技術研究中心，山東泰安 271018；2.泰安市泰山景區(qū)桃花峪管理區(qū)，山東泰安 271000）

肥桃Prunus persica‘Feicheng'是山東省肥城市乃至全國獨特的桃品種，是中國水果名優(yōu)特產之一。種植面積達到了近7 000 hm2，年產量1.6 億公斤，經濟和社會效益顯著。近幾年來，肥桃流膠病發(fā)生嚴重，對肥桃的生產、銷售造成了極大影響。

多數學者認為桃樹流膠病是生理現象，屬于非侵染性病害[1]。20 世紀 70 年代，Weaver 第 1 次分離出Botryosphaeria dothidea，人們才發(fā)現真菌可導致桃樹流膠病的發(fā)生[2]。1863 年葡萄座腔菌屬才被正式定義[2]。在上海、廣州、湖北等南方桃產區(qū)陸續(xù)發(fā)現Physalospora persicae[3]、Botryosphaeria dothidea[4]、Cucurbitaria[5]、Leptosphaeria[5]等屬真菌也導致桃流膠病。多種報道認為葡萄座腔菌屬真菌Botryosphaeriaspp.可引起桃流膠病[6-9]。B.dothidea進入寄主組織可通過皮孔，氣孔或樹皮上小的傷口途徑侵入[10]。大量研究表明，溫度、濕度是影響桃流膠病發(fā)生的重要因素[11]，氣溫高、降雨量大是春夏桃流膠暴發(fā)的主要原因，入冬后，低溫、少雨等因素抑制病害發(fā)生[12-17]。

筆者首次對肥城桃樹流膠病的發(fā)病情況進行了全面調查，通過大量樣本采集和分離鑒定明確了肥桃流膠病病原的分類地位，以期為肥桃流膠病的科學防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

1.1.1 發(fā)病情況調查 2017 年9 月在肥城市的西尚里村、東尚里村、劉臺村景區(qū)、南尚里村和桃園鎮(zhèn)肥桃種植區(qū)5 個主要肥桃產區(qū)中選取多年生桃樹，每個肥桃產區(qū)按照東南北四個方位分別選取4 個桃園，每個方位的桃園選取15 棵樹勢相似、栽培條件相同的桃樹進行桃流膠病的發(fā)病率及發(fā)病程度的調查與統計。每次每個種植區(qū)調查60 株，計算發(fā)病率和病情指數。

發(fā)病率（%） =發(fā)病總株數/調查總株數×100

病情指數 = ∑（各級病株數 × 相應病級值）/（調查總株數×最高病級值） ×100

桃流膠病發(fā)病程度的分級標準，參考羅江會[1]制定的桃流膠病害分級標準。

表1 桃流膠病病害分級標準Tab.1 The classification standard of peach gummosis disease

1.2 樣本采集 2016—2018 年共6 次在山東省肥城市的西尚里村、東尚里村、劉臺村景區(qū)和南尚里村、桃園鎮(zhèn)肥桃種植區(qū)5 個主要肥桃產區(qū)，分別選取典型桃園內5 個采樣點的不同方位（東、南、西、北、中），采用隨機取樣的方法，在每個桃園采集5 組具有典型癥狀的病枝，共計125 個病枝作為試驗材料并編號。

1.3 病原菌的分離與純化 采用組織分離法進行病原菌分離[18]。每個病枝分離25 個病健交界組織，放置于 PDA 平板放入28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)[19]。5 d 后，觀察病組織分離情況，統計微生物的種類和數量。將上述分離的微生物，按照不同類型進行純化培養(yǎng)，獲得單一的微生物。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 培養(yǎng)特性觀察 分離純化的菌株繼續(xù)在28 ℃下培養(yǎng)。觀察記錄菌絲形態(tài)、菌落邊緣特征、菌落顏色變化特征。

1.4.2 形態(tài)學特性觀察 供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上觀察其子實體大小、顏色等形態(tài)，顯微鏡下觀察病菌分生孢子器和分生孢子大小、形狀和顏色等形態(tài)，分別測定100 個分生孢子器和分生孢子。

1.4.3 ITS 序列鑒定 采用2 ×CTAB 法進行基因組的 DNA 提取，采用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 進行 PCR 擴增[20]，經過瓊脂糖凝膠電泳，將上述所獲得的PCR 產物經純化后送公司測序，獲得的序列與GenBank 核酸數據庫中相關菌株進行比對，用MEGA5.0 軟件構建系統發(fā)育樹，對ITS 基因序列數據進行NJ（Neighbor Joining）分析，以啟發(fā)式搜索獲得系統發(fā)育樹，鑒定病原菌種類和分類地位。

1.5 致病性測定 從7 種類型的分離菌株中各挑選1 個典型菌株分離純化后，選取3 個菌株重復，按照柯赫氏法則，分別接種到與分離物來源一致的肥城紅里桃2 a 生健康枝條上，7 d 后確定分離物致病性。采用離體刺傷接種法。剪取紅里肥桃15 cm 長的2 a生枝條，用清水沖洗后用75 %酒精進行表面消毒，無菌水漂洗3 次后用吸水紙吸干水分；用無菌針在枝條中間部位針刺5 針，將準備好的菌絲塊接種于傷口處，以PDA 瓊脂塊同樣處理接種為對照；于25 ℃條件下培養(yǎng)。測量7 d 時枝條病斑長度，比較不同分離菌株的致病力大小，根據柯赫氏法則，對枝條發(fā)病病斑進行再分離，觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。

2 結果與分析

2.1 肥桃流膠病發(fā)病情況 基于2017 年對5 個主要肥桃產區(qū)的肥桃流膠病田間癥狀調查，肥城市肥桃流膠病發(fā)生較為嚴重，肥城桃產區(qū)平均發(fā)病率為61.77%，最高發(fā)病率 88.0%；平均病情指數為24.9，最高病情指數為26.9（表2）。

表2 肥城市各桃園肥桃流膠病發(fā)病率和病情指數Tab.2 Incidence rate and disease index of peach tree gummosis disease in Feicheng city

2.2 肥桃流膠病病原鑒定

2.2.1 采集分離純化獲得的病原菌株 2016—2018 年通過對125 個病枝分離純化后共獲得160個菌株，根據培養(yǎng)特征分為7 個類型，其分離純化結果見表3。類型1 和類型4 是病斑上分離到的優(yōu)勢菌株，其他菌株是偶發(fā)的菌株。

2.2.2 病斑分離物菌落培養(yǎng)特性

類型1 菌株生長較為旺盛，菌落生長速度快，菌絲呈棉絮狀；中部菌絲較外緣菌絲旺盛，菌絲初為白色，后由中心向四周輻射狀變黑；最終整個菌落呈現墨黑色。

表3 肥桃流膠病菌株分離結果Tab.3 Isolation result of pathogen from peach gummosis spots

類型2 菌株菌絲生長相對平緩，菌落扁平；菌絲初為白色后顏色逐漸變深直至變?yōu)楹谏?/p>

類型3 菌株菌絲生長非常旺盛，后期菌絲可生長至培養(yǎng)皿頂端，整個菌落呈棉絮狀，菌絲顏色變化為先白后黑。

類型4 菌株菌絲生長平緩，呈絨毛狀，菌絲初為白色，后逐漸呈輻射狀變紅，直至整個菌落呈磚紅色。

類型5 菌株菌絲白色，生長平緩；外圍菌絲較內部菌絲旺盛。

類型6 菌株菌絲白色，匍匐，中部菌絲比四周菌絲生長旺盛。

類型7 菌株菌絲疏松、生長旺盛，菌落外圍一圈菌絲生長旺盛，菌絲顏色初為白色，后逐漸變?yōu)闇\紅色。

7 個類型菌株的培養(yǎng)菌落形態(tài)見圖1。

圖1 肥桃流膠病病斑分離物菌落培養(yǎng)特征Fig.1 Culture characteristics of strains isolated from peach gummosis disease spots

2.2.3 病斑分離物的形態(tài)學特性 顯微鏡下，部分菌株的子實體形態(tài)見圖2；7 種類型菌株的分生孢子形態(tài)見圖3；7 種類型菌株的分生孢子器和分生孢子形態(tài)描述如表4。

圖2 肥桃流膠病病斑分離菌株子實體形態(tài)學特征Fig.2 Morphological characteristics of fruiting body of strains isolated from peach gummosis disease spots

圖3 肥桃流膠病病斑分離菌株分生孢子形態(tài)學特征Fig.3 Morphological characteristics of conidiospore of isolated strains from peach gummosis disease spots

表4 肥桃流膠病病斑分離物形態(tài)學特征Tab.4 Morphological characteristics of strains isolated from peach gummosis disease spots

2.2.4 病原菌分子鑒定 從分離菌株的rDNA-ITS的PCR 擴增、BLAST 序列比對結果（圖4）可以看出類型1（菌株 T1、T9、T15、T16、T19、T22）與Botryosphaeria dothidea序列相似性100%；類型2（菌株L11） 與Lasiodiplodia theobromae的序 列 相 似性98%；類型3（菌株T7）與B.obtusa（無性態(tài)為Diplo-dia seriata） 的序列相似性 99%；類型 4 （菌株F27-2、F8-2）與Fusarium lateritium的序列相似性100%；類型5（菌株F11-3）與F.fujikuroi的序列相似性100%；類型 6（菌株 F3-3、F44-2、F13-2、F39-3）與F.proliferatum的序列相似性100%；類型7（菌株F38-2）與F.oxysporum序列相似度100%。

圖4 基于rDNA-ITS 序列的桃樹流膠病病原菌株系統發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence of isolated strains of peach gummosis disease spots

2.2.5 病原菌致病性 所有接種菌株均能引致枝條病斑出現。接種后48 h 就有水漬狀病斑產生，圓形至橢圓形，隨時間推移病斑由淺褐色變?yōu)楹稚?，且逐漸向四周擴展，病斑出現凹陷及流膠（圖5）。

圖5 肥桃流膠病斑分離物接種健康枝條發(fā)病癥狀Fig.5 Symptoms of peach gummosis disease using isolated strains inoculation in healthy shoot

對發(fā)病枝條的病斑處進行再分離及鑒定，均可獲得與原接種菌株一致的病原菌，因此確定T1 菌株（B.dothidea）、T7 菌株（B.obtusa）、L11 菌株（Lasiodiplodia theobromae）、F8-2 菌株（F.lateritium）、F44-2 菌株（F.proliferatum）、F11-3 菌株（F.fujikuroi）和 F38-2 菌株（F.oxysporum）均可致肥桃流膠病發(fā)生，即B.dothidea、B.obtusa、Lasiodiplodiae theobroma、F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateritium7 種病原菌為肥城桃流膠病的病原菌。表5 也表明不同接種菌株致病力有差異，綜合以上結果Botryosphaeria dothidea和Fusarium lateritium是引起肥桃流膠病的優(yōu)勢病原。

表5 接種7 d 后肥桃流膠病病斑代表分離菌株的致病性測定Tab.5 Lesion diameters in shoots inoculated with seven strains seven days after inoculation

3 討論與結論

綜合肥桃流膠病病斑分離物的培養(yǎng)學、形態(tài)學、ITS 序列及致病力測定，明確了肥桃流膠病可由7種真菌引起，包括B.dothidea、B.obtusa、Lasiodiplodia theobromae、F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateritium，其中B.dothidea和F.lateritium是優(yōu)勢種，其他均是偶發(fā)種，這7 種病原菌間的互作及其與肥桃流膠病的關系，尚需繼續(xù)研究。

本研究中共分離出鐮孢菌類菌株4 種，為F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateritium，在肥桃流膠病病原研究中，這是首次發(fā)現鐮孢菌類真菌為致病菌。F.lateritium分離率最高，為優(yōu)勢病原菌。但在鐮孢菌類菌株致病性測定試驗中，F.lateritium的致病力卻最低。F.fujikuroi與F.proliferatum的致病性差異不大，明顯高于F.lateritium與F.oxysporum兩類菌株。但鐮孢菌種類病原菌無論分離率還是致病性均低于葡萄座腔菌。

本實驗中，鐮孢菌類菌株的分離比率明顯低于葡萄座腔菌菌株，并且在分離過程中發(fā)現，鐮孢菌類菌株與葡萄座腔菌菌株全部相伴而生，沒有發(fā)現鐮孢菌類菌株單獨被分離的現象，由此推論葡萄座腔菌類菌株是肥桃流膠病主要病原菌，鐮孢菌類菌株是伴生病原菌，可混合侵染危害。