王承霞，朱玉蓉

（江蘇省腫瘤醫(yī)院&江蘇省腫瘤防治研究所&南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210009）

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤，在我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年攀升，占到所有女性癌癥患者的15%，并以每年2.7%的比例快速增長，每年新增病例約278 800人，死亡人數(shù)約64 600人，嚴(yán)重危害人們的健康和生活[1-3]。因此，積極篩選乳腺癌診斷和預(yù)后的分子靶標(biāo)，對(duì)提高乳腺癌檢出率和治愈率具有重要意義[4-5]。

RNA組學(xué)如今成為研究熱點(diǎn)，惡性腫瘤的研究從功能基因?qū)用妫ň幋a蛋白質(zhì)）逐漸拓展到非編碼RNA領(lǐng)域，極大豐富人們對(duì)遺傳信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解。研究表明，除編碼蛋白基因外，超過基因組產(chǎn)物90%的非編碼RNA，同樣廣泛參與細(xì)胞生長、發(fā)育等生命環(huán)節(jié)，在多個(gè)層面調(diào)控基因而發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)一種由轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNAs）加工而成，來源于tRNA前體或成熟序列的小非編碼RNA，即tRNA及其來源片段（tRNA-derived fragments）參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，成為與腫瘤相關(guān)的研究新熱點(diǎn)[7-9]。然而這些來源于tRNA前體或成熟序列的小非編碼RNA在乳腺癌中的研究鮮有報(bào)道。本文采用RT-PCR方法首次檢測乳腺癌患者血清中tRF-32-Q99P9P9NH57SJ（tRF-32）的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平與乳腺癌患者的臨床病理資料的關(guān)系，初步探討tRF-32的表達(dá)水平對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年11月～2019年2月在江蘇省腫瘤醫(yī)院乳腺外科住院治療的患者，其中乳腺癌患者51例（乳腺癌組），年齡29～76歲，平均年齡52.08±1.34歲，病例均經(jīng)本院病理科確診。臨床分期：I期9例，II期18例，III期11例，IV期13例；30例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，21例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有患者均未行放、化療等抗腫瘤治療；體檢后未見明顯器質(zhì)性疾病的女性25例為健康對(duì)照組，年齡28～69歲，平均年齡49.48±1.63歲，所有研究對(duì)象均抽取清晨空腹靜脈血5 ml，靜置30 min后，以3 000 r/min離心10 min，分離血清放置-80℃凍存待檢。

1.2 試劑和儀器 ViiA 7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (Applied Biosystems)，TRIzol LS 試 劑（life technologies，美國），rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit (Cat#: AS-FS-005, Arraystar, MD, 美國)，rtStarTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (3’ and 5’ adaptors) (Cat#: AS-FS-003, Arraystar, MD, 美 國) ，2X PCR master mix（Arraystar，MD, 美國）。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取和純度檢測：從冰箱中取出血清樣品，解凍后于4℃12 000×g離心10min，去除可能存在的雜質(zhì)，取250μl血清，轉(zhuǎn)至1.5ml的離心管中，加入750μl的TRIzol LS Reagent 試劑（invitrogen life technologies）和20μl冰醋酸采用Trizol法提取總RNA。純度檢測：紫外分光光度計(jì)檢測總RNA純度，A360mm/A280mm的比值0.82，說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。

1.3.2 RNA前處理與cDNA合成：使用rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit 試劑盒進(jìn)行預(yù)處理，去除3’氨酰基末端與3’環(huán)磷酸末端，磷酸化5’羥基末端，并移去m1A, m3C等多種甲基化修飾。使用rtStarTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進(jìn)行接頭連接和反轉(zhuǎn)，合成cDNA第一鏈。

1.3.3 RT-PCR檢測血清中tRF-32表達(dá)水平：以U6為內(nèi)參，使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)U6和tRF-32的引物序列：

反應(yīng)條件：95℃10min；40個(gè)PCR循環(huán)[（95℃，10s；60℃，60s（收集熒光）]。所有樣本設(shè)置3復(fù)孔，采用2-ΔCt方法計(jì)算血清中tRF-32的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0和GraphPad Prism v6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。血清中tRF-32表達(dá)模式與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。血清tRF-32在乳腺癌診斷中的診斷效能采用ROC曲線來評(píng)價(jià)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者血清中tRF-32的表達(dá)分析 運(yùn)用RT-PCR檢測51例乳腺癌患者和25例健康對(duì)照者血清標(biāo)本中tRF-32的表達(dá)量。tRF-32的擴(kuò)增曲線和溶解曲線見圖1，溶解曲線呈單峰。51例乳腺癌患者血清中tRF-32的表達(dá)量（13.84 ± 2.62）與25例健康對(duì)照組（39.47 ± 7.21）比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 4.091, P ＜ 0.000 1）。結(jié)合臨床病理特征分析，TNM分期中I-II期（n=27）的tRF-32表達(dá)量（16.97 ± 3.315）高于 III-IV 期（n=24）tRF-32表達(dá)量（7.07 ± 2.83），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.241, P = 0.029），同時(shí)無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（n=21）患者血清中的tRF-32表達(dá)量(18.75 ± 3.91)明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（n=30）患者血清中tRF-32表達(dá)量(7.80 ± 2.51)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.47, P = 0.017）。

2.2 tRF-32與乳腺癌臨床病理參數(shù)關(guān)系 見表1。分析上述51例乳腺癌患者血清中tRF-32的表達(dá)量與臨床病理參數(shù)關(guān)系，根據(jù)血清中tRF-32表達(dá)量的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，采用卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)tRF-32表達(dá)量與乳腺癌患者年齡無關(guān)（P＞0.05），而與TNM分期（χ2=8.463, P = 0.004）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=5.856, P = 0.016） 密切相關(guān)。

圖1. tRF-32的擴(kuò)增曲線和溶解曲線

表1 乳腺癌血清tRF-32的表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系

2.3 ROC曲線分析 運(yùn)用ROC曲線分析tRF-32對(duì)乳腺癌的診斷效能，見圖2。血清中tRF-32診斷乳腺癌的ROC曲線AUC是0.776（95% CI: 0.673～0.880），敏感度和特異度分別為84.0 %和68.8%，以上提示血清tRF-32對(duì)評(píng)價(jià)乳腺癌有診斷意義。

圖2 血清tRF-32診斷乳腺癌的ROC曲線分析

3 討論

隨著RNA-se q技術(shù)的廣泛應(yīng)用和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，ncRNA領(lǐng)域的tRFs&tiRNAs引起廣泛關(guān)注。目前認(rèn)為，在特定條件下，tRNA發(fā)生切割，產(chǎn)生功能性小片段（tRNA-derived Frangments），主要包括tRNA的一半（tRNA-derived stress-induced RNAs; tiRNA）；tRNA衍生的片段（tRNA-derived fragments; tRFs）以及tRNA衍生的 小tRNA（tRNA-derived small RNAs；tsRNAs）[10]。近年來，更多的功能性小片段（tRNA-derived frangments）被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)其功能研究只是龐大的tRFs&tiRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的冰山一角，大量tRFs&tiRNAs的未知功能有待探討[11-12]。因此，從tRFs&tiRNAs角度進(jìn)一步挖掘乳腺癌新型分子靶標(biāo)，將有助于揭示乳腺癌發(fā)生發(fā)展新機(jī)制，為臨床診療提供新思路。

tRFs&tiRNAs通過類似于miRNA降解mRNA的作用機(jī)制，調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性，參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長[11-12]。研究顯示，tRFs&tiRNAs與YBX1結(jié)合，調(diào)控腫瘤基因轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展，提示這類tRFs&tiRNAs是一類新的抑癌因子[13]。DHAHBI等[14]在小鼠血清中發(fā)現(xiàn)tiRNAs穩(wěn)定性表達(dá)，具有轉(zhuǎn)錄前抑制功能，提示其可能是一類新型信號(hào)分子。

由于tRNA上存在大量的轉(zhuǎn)錄后修飾，而且tRNA需與氨基酸形成氨酰基tRNA方可參與蛋白翻譯。當(dāng)tRNAs被切割為tRFs&tiRNAs時(shí)，這些修飾（包括甲基化修飾、氨?；┒诵揎棧?huì)全部或部分的保留下來。tiRNAs常由RNA內(nèi)切酶Angiogenin切割產(chǎn)生，這類內(nèi)切酶會(huì)在切割位點(diǎn)產(chǎn)生5’羥基（5’-OH）末端與3’環(huán)磷酸（3’-cP）末端[15-16]。然而，5’端與3’端的接頭連接步驟，需要底物小RNA 5’端為磷酸，3’端為羥基。此外，某些tRFs&tiRNAs的內(nèi)部修飾比如m1A, m1G與m3C會(huì)嚴(yán)重阻礙反轉(zhuǎn)錄過程。因此為了準(zhǔn)確檢測tRFs&tiRNAs，這些修飾必須被有效的去除[17]。所以本課題在采用RT-PCR檢測乳腺癌患者血清中tRF-32的表達(dá)水平之前，采用專門試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行了去甲基化等前處理。

分析RT-PCR結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，tRF-32在乳腺癌患者血清中低表達(dá)，并且其表達(dá)水平與乳腺癌臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。血清中tRF-32表達(dá)程度越低，乳腺癌TNM分期越高，同時(shí)更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。tRF-32用于乳腺癌診斷的敏感度為84.0 %，特異度為68.8%，對(duì)評(píng)價(jià)乳腺癌有一定的診斷價(jià)值。這些研究結(jié)果提示tRF-32在乳腺癌中低表達(dá)，可能發(fā)揮抑癌基因的作用，同時(shí)在乳腺癌中具有早期診斷和治療的潛在價(jià)值。

本課題下一步計(jì)劃是擴(kuò)大血清樣本量，收集更完整的臨床資料，評(píng)價(jià)血清中tRF-32的臨床價(jià)值。同時(shí)通過靶基因預(yù)測軟件尋找tRF-32可能的靶基因，并在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平加以驗(yàn)證，探討tRF-32在乳腺癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮的作用，為確定tRF-32成為腫瘤診斷和治療的生物學(xué)指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。