陳昌國，陳秋圓，侯兵兵，劉新萍,董優(yōu)優(yōu)

（解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心檢驗科，北京 100048）

溶藻弧菌是一種常見的嗜鹽性革蘭氏陰性弧菌，有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，廣泛分布于海水及河口入海處，其數(shù)量在海洋各類弧菌中居于首位[1-3]。溶藻弧菌由Miyamoto在1961年命名，其生物學(xué)特性與副溶血弧菌有較多相似之處，是水生動物弧菌病的主要病原菌之一[1,4-5]。此外，溶藻弧菌不但會引起多種人類感染性疾病，如傷口感染、食物中毒及中耳炎等，嚴(yán)重時可引起敗血癥危及生命[6-9]；而且，該菌是沿海地區(qū)感染性腹瀉和食物中毒的主要病原菌之一，其作為致病菌的相關(guān)研究日益受到重視[10-11]。

目前，分子生物學(xué)檢測溶藻弧菌的靶點有16s rRNA 基因、colH基因、dnaJ40基因以及hsp60基因等[10]。雖然16s rRNA 基因是細(xì)菌分子系統(tǒng)鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其進(jìn)化上的過度保守不利于區(qū)分相似種，而更適用于種以上水平的鑒定[12-13]。gyrB即促旋酶（gyrase）B亞基，其在細(xì)菌中廣泛存在，與16sRNA相比，gyrB基因進(jìn)化速度更快且在近乎全部細(xì)菌中呈單拷貝形式，更適用于細(xì)菌種的鑒定。在弧菌中g(shù)yrB基因具有較高同源性，不同弧菌之間具有明顯遺傳距離，其穩(wěn)定準(zhǔn)確區(qū)分不同弧菌的特點使得它可以作為檢測的靶點[14]。本實驗以溶藻弧菌gyrB基因為研究對象，基于LAMP技術(shù)建立一種溶藻弧菌的快速檢測方法，實驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實驗使用的菌株包括：溶藻弧菌ATCC-17749（由李艷君博士提供）、溶藻弧菌野生株-WT (由本科室分離并保存)、糞腸球菌ATCC-29212、金黃色葡萄球菌ATCC-25293、腐生葡萄球菌ATCC-BAA750、霍氏腸桿菌ATCC-700323、銅綠假單胞菌ATCC-27853、大腸埃希氏菌ATCC-25922菌株均為本科室保存。

1.2 試劑和儀器 普通恒溫水浴，凝膠電泳儀均是本科室常用設(shè)備。0.1mmol/L MgSO4溶液，10×Reaction Buffer,Solution Mix, Bst DNA聚合酶均購自New England Biolabs公司，特異性引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，后期處理按照引物合成單說明進(jìn)行操作,引物序列見表1。

表1 gyrB基因LAMP引物序列

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌核酸粗提物制備：將菌種從-80℃冰箱取出后快速復(fù)溫并接種在TCBS、哥倫比亞血平板上，將平板置孵箱中37℃培養(yǎng)12h，取適量細(xì)菌至含有100μl核酸裂解液的EP管中，室溫裂解15min,中間渦旋振蕩3次，100℃恒溫金屬浴加熱10min， 1 3000r/min室溫離心5min,取上清作為模板。

1.3.2 LAMP反 應(yīng) 體 系：10×Bst r/min buffer 2.5 μl,MgSO4(25mmol/L) 1.2μl，dNTP (10mmol/L) 1.6 μl，內(nèi)引物各0.8μmol，外引物各0.2μmol，Bst DNA聚合酶 (8 U/μl) 1μl，DNA模板2 μl，ddH2O 15.7 μl。

1.3.3 反應(yīng)溫度的優(yōu)化：將相同反應(yīng)混合液在不同的溫度下(60，61，62和63℃）反應(yīng)60min，80℃滅活5min，取5μl反應(yīng)產(chǎn)物在2g/dl凝膠中進(jìn)行電泳，以出現(xiàn)清晰明顯條帶的反應(yīng)溫度為優(yōu)，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.3.4 反應(yīng)時間的優(yōu)化：將相同反應(yīng)混合液在61℃分別反應(yīng)60 min和90 min，然后80℃滅活5 min，將反應(yīng)產(chǎn)物在2g/dl凝膠中進(jìn)行電泳，以出現(xiàn)條帶的清晰程度判斷反應(yīng)時間對擴(kuò)增效果的影響。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度下擴(kuò)增效果的比較 凝膠電泳結(jié)果見圖1。不同反應(yīng)溫度獲得的擴(kuò)增效果不一，61℃條件下得到的gyrB擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶最清晰明顯，提示61℃為適宜反應(yīng)溫度。

圖1 不同溫度gyrB基因LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.2 不同反應(yīng)時間擴(kuò)增效果的比較 見圖2。在61℃反應(yīng)60 min和90 min擴(kuò)增效果相差不大，反應(yīng)條件使用60min反應(yīng)時間即可滿足實驗要求。

圖2 不同反應(yīng)時間gyrB基因LAMP擴(kuò)增效果

2.3 特異性評價 使用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系對溶藻弧菌野生株、溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及其它6種常見致病細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示僅溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和溶藻弧菌野生株有g(shù)yrB基因陽性擴(kuò)增條帶，其它6種常見致病細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株均無擴(kuò)增條帶，見圖3。提示該反應(yīng)體系的特異度較好。

圖 3 溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、溶藻弧菌野生株及其它種細(xì)菌gyrB基因擴(kuò)增條帶

2.4 靈敏度評價 將溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株提取的核酸母液進(jìn)行系列稀釋作為擴(kuò)增反應(yīng)模板，當(dāng)濃度為102mg/L～10-4mg/L時，每個濃度均有g(shù)yrB陽性擴(kuò)增條帶，當(dāng)濃度為10-5mg/L時未出現(xiàn)gyrB擴(kuò)增條帶。所以，該反應(yīng)體系的檢測靈敏度為10-4mg/L，與我們前期Taqman熒光定量PCR結(jié)果相比[20]具有較好的靈敏度，見圖 4。

圖4 不同濃度核酸gyrB基因的LAMP擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

溶藻弧菌是海水中最常見的優(yōu)勢弧菌，既是海水養(yǎng)殖動物的重要致病菌，也是多種人類疾病的致病菌，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及人類健康有著重要影響[15]。目前，溶藻弧菌的檢測主要是傳統(tǒng)的微生物鑒定方法和常規(guī)的分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定檢測方法完成一個鑒定周期用時較長且步驟繁瑣；常見的分子生物學(xué)方法如普通PCR、熒光定量PCR等不但需要PCR儀且對場地和人員的操作要求相對較高，不利于在條件相對簡陋的條件下展開工作[16]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)是由NOTOMI等[17]于2000年報道的一種核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)，其原理是針對靶基因的6個位點設(shè)計2對特異性引物（內(nèi)、外引物各一對），應(yīng)用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA酶）通過鏈置換方式進(jìn)行高效擴(kuò)增，具有高特異度、高靈敏度、簡便、快速、低成本及對儀器要求低的特點，已廣泛應(yīng)用于微生物、病毒、寄生蟲等多種領(lǐng)域[18-19]。

本研究中通過在線軟件針對gyrB基因設(shè)計了LAMP引物，首先將反應(yīng)體系在不同溫度條件進(jìn)行反應(yīng)，2g/dl凝膠電泳結(jié)果顯示61℃的反應(yīng)條件下擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶最為清晰，效率較高；在確定了反應(yīng)條件后我們對反應(yīng)時間的長短進(jìn)行了優(yōu)化，2g/dl凝膠電泳結(jié)果顯示在最佳反應(yīng)溫度下反應(yīng)60 min的效果即能滿足后續(xù)實驗的要求并不需要延長反應(yīng)時間來提高擴(kuò)增效率。確定反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間后，我們對該方法的特異度和敏感度進(jìn)行了評估。該體系在特異性檢測中溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株和溶藻弧菌野生株擴(kuò)增結(jié)果為陽性，其它菌株擴(kuò)增結(jié)果為陰性，可以有效地對溶藻弧菌及其它6種常見致病菌進(jìn)行區(qū)分，具有較好的特異度；在敏感度檢測中當(dāng)溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株核酸模板濃度為102～10-4mg/L時，每個濃度均出現(xiàn)陽性擴(kuò)增條帶，當(dāng)模板濃度降低到10-5mg/L時未出現(xiàn)陽性條帶，說明該體系檢測的靈敏度為10-4mg/L。

綜上所述，我們基于LAMP技術(shù)建立了一種以gyrB基因為分子靶點的快速、簡便、準(zhǔn)確的溶藻弧菌檢測方法，對溶藻弧菌的快速檢測具有重要意義。