張碧薇，楊峰，樊繼德

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 徐州 221121)

大蒜營養(yǎng)價(jià)值豐富，風(fēng)味獨(dú)特，主要食用部分為大蒜鱗莖。在我國，大蒜的利用歷史悠久，特別是在食用和藥用方面。《本草綱目》指出大蒜具有“通五臟、達(dá)諸竅、去寒濕、避邪惡、消臃腫、化積食”等功能；其中大蒜素被譽(yù)為“天然廣譜抗生素”，蒜氨酸作為大蒜素的前體物質(zhì)，被稱為“地里長出來的青霉素”[1]。大蒜的藥用價(jià)值引起了廣大研究者的極大興趣。隨著對大蒜功效的深入研究，發(fā)現(xiàn)大蒜在加工過程中所轉(zhuǎn)化成的有機(jī)硫化物是其發(fā)揮生物活性的主要功效成分，但由于提取工藝的不同導(dǎo)致大蒜有機(jī)硫化物的組分也略有不同，因此，文章對近幾年大蒜有機(jī)硫化物的提取工藝及檢測技術(shù)進(jìn)行研究，以期促進(jìn)大蒜有機(jī)硫化物的進(jìn)一步開發(fā)。

1 有機(jī)硫化物的形成

含硫有機(jī)化合物是大蒜中主要的生物活性物質(zhì)之一，其包括活性成分前體物蒜氨酸、大蒜素以及大蒜素的降解產(chǎn)物二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物等[2,3]。

大蒜素并不直接存在于完整的大蒜鱗莖中，而在大蒜鱗莖中只含有它的前體物蒜氨酸，蒜氨酸以穩(wěn)定、無臭的形式存在于完整的大蒜鱗莖中，參與高等植物的二級(jí)代謝[4]。當(dāng)大蒜受到外力的作用時(shí)，使得組織細(xì)胞受損，原來位于不同部位的蒜氨酸與蒜氨酸酶受力相互接觸，在磷酸吡哆醛的輔助作用下產(chǎn)生不穩(wěn)定的二烯丙基硫代亞磺酸酯，即大蒜素[5]。在溫室條件下，大蒜素可迅速降解生成二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物、阿藿烯等各種含硫有機(jī)化合物[6]。大蒜的活性成分主要是有機(jī)硫化物，其中大蒜素的生物活性最強(qiáng)[7]，是大蒜重要的生物活性成分，研究表明，大蒜素具有抗菌、降血壓、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種保健功效[8]，在食品保健、醫(yī)學(xué)藥用、畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景[9-11]。因此，文章重點(diǎn)對大蒜素及其前體物質(zhì)蒜氨酸的提取工藝及檢測技術(shù)研究作一綜述。

2 有機(jī)硫化物的提取技術(shù)

2.1 蒜氨酸提取分離純化技術(shù)

蒜氨酸的提取方法主要有純水提取法、烯醇提取法、有機(jī)溶劑提取法。將大蒜中的蒜氨酸先進(jìn)行粗提取，然后對粗提蒜氨酸進(jìn)行分離純化。目前，離子交換法是蒜氨酸分離純化常用的方法之一。蒜氨酸是兩性化合物，強(qiáng)酸條件下不易分解，用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂分離蒜氨酸，能夠避免大量的糖類物質(zhì)發(fā)生交換，使得蒜氨酸得到了較好的交換。同時(shí)氨基酸的等電點(diǎn)不同，被洗脫下來的順序也不同，分段收集洗脫液，可以使蒜氨酸與其他氨基酸實(shí)現(xiàn)分離，獲得較純的蒜氨酸溶液，最后重結(jié)晶得到天然蒜氨酸純品。因此，強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂適合蒜氨酸的分離純化，而且成本少、操作簡便、高效節(jié)能。Jiang Xiumin等[12]采用雙水相萃取-層析兩步法從大蒜粉中對蒜氨酸進(jìn)行了提取和純化，他們考察了不同類型的雙水相體系對蒜氨酸的分配系數(shù)和產(chǎn)率的影響，并采用響應(yīng)面分析法對萃取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最佳提取條件：19%硫酸銨和20% 1-丙醇在30 ℃、pH 2.35、氯化鈉濃度8.54%的條件下蒜氨酸提取率較高，與傳統(tǒng)的提取方式相比，雙水相萃取法的蒜氨酸提取率是傳統(tǒng)方式的3倍。采用磺酸陽離子交換樹脂對蒜氨酸進(jìn)行純化，將1 mg/mL的蒜氨酸粗提溶液通過樹脂，流動(dòng)相為純水，分別以0.5，1.5 mL/min的流速對其進(jìn)行洗脫、分段收集。

2.2 大蒜素的提取技術(shù)

2.2.1 水蒸氣蒸餾法

水蒸氣蒸餾法是將水蒸氣通入大蒜勻漿中，使大蒜素在100 ℃以下的溫度下隨水蒸氣一起蒸餾出來，然后經(jīng)過進(jìn)一步的分離獲得較純的物質(zhì)。該方法設(shè)備簡單，操作方便，成本較低，穩(wěn)定性好，易于推廣，是常用的方法之一。但由于蒸餾的溫度相對較高，蒜氨酸酶的活性降低，大蒜素的提取率隨之降低，同時(shí)熱敏物質(zhì)大蒜素受熱不穩(wěn)定、易降解生成硫醚類化合物，風(fēng)味差，有效成分低[13]。劉陽等[14]通過正交試驗(yàn)，對水蒸氣蒸餾法提取大蒜揮發(fā)油的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，并利用GC-MS進(jìn)行成分分析。結(jié)果表明：大蒜揮發(fā)油的最佳提取工藝為超聲時(shí)間35 min、浸泡溫度35 ℃、料液比1∶4、蒸餾時(shí)間2 h，在此條件下大蒜揮發(fā)油的實(shí)際提取率為0.280%。

2.2.2 有機(jī)溶劑萃取法

溶劑萃取法利用大蒜素易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑這一性質(zhì)，所以用這些溶劑或幾種溶劑混合作為提取劑，將大蒜素浸提出來。有機(jī)溶劑萃取法與水蒸氣蒸餾法相比，不需要經(jīng)過加壓、蒸餾等操作，而且未經(jīng)過高溫作用，主要成分就是大蒜素，更好地保留了大蒜的獨(dú)特風(fēng)味。但是該法的有機(jī)溶劑易殘留，所以選擇萃取溶劑非常關(guān)鍵，現(xiàn)在一般大都采用乙醇作為萃取溶劑。有機(jī)溶劑萃取法具有設(shè)備簡單、操作便利、生產(chǎn)能力大、提取周期短、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，故應(yīng)用相當(dāng)廣泛。Li Fenfang等[15]研究了乙醇/硫酸銨體系對大蒜素提取和初步純化的影響，在響應(yīng)面分析試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得出大蒜素的最佳提取條件為：乙醇濃度為23%，硫酸銨濃度為24%，樣品濃度為31 g/L，提取溫度為25 ℃，不調(diào)節(jié)pH，在該條件下，獲得大蒜素的提取率為94.17%，而且，當(dāng)提取量增加時(shí)，提取效率沒有明顯的下降。

2.2.3 超臨界CO2萃取法

超臨界CO2萃取法是以超臨界氣體(CO2)作為萃取劑，從固體或液體樣品中萃取出所需成分并進(jìn)行分離的技術(shù)。由于CO2具有較低的臨界溫度和壓力，所以該法常被用來萃取非極性和極性較低的物質(zhì)。超臨界CO2萃取法與其他常用提取方法相比，溫度較低，大蒜素不易分解，無殘留溶劑，風(fēng)味更接近新鮮大蒜，提取率高，但是工藝成本高、設(shè)備比較復(fù)雜、操作條件較為嚴(yán)格。José M等[16]研究了超臨界 CO2萃取凍干大蒜汁中大蒜油的最佳萃取條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大蒜油的萃取率隨著萃取壓力的增強(qiáng)(15～45 MPa)而略有增加，而隨著萃取溫度的升高(35～65 ℃)而顯著增加，但是隨著溫度的升高，提取物中的大蒜素濃度降低，因此大蒜油最佳的萃取條件為：萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為55 ℃，CO2流量與蒜汁流量比為55∶1 (kg/kg)，萃取時(shí)間為4 h。

2.2.4 其他提取方法

詹盛文等[17]使用超聲波輔助萃取法提取大蒜素，以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇作為提取液，考察了酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲功率和超聲溫度4個(gè)因素對大蒜素提取率的影響。在考察單因素試驗(yàn)對提取效果影響的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得大蒜素的最佳提取條件：酶解溫度為35 ℃，酶解時(shí)間為31 min，超聲功率為49 W，超聲溫度為29 ℃，大蒜素的得率為3.018 mg/g，而且超聲波輔助提取大蒜素具有顯著作用。Sankhadip Bose等[18]研究了超聲波和微波輻射對鮮蒜主要成分的影響，并采用高效液相色譜-紫外分光光度法測定鮮蒜中大蒜素的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，輻照工藝保留了新鮮大蒜的主要成分，大蒜素以純凈的形態(tài)存在，該工藝比傳統(tǒng)提取方法獲得更高的產(chǎn)量。

3 有機(jī)硫化物的檢測

3.1 蒜氨酸的檢測技術(shù)

蒜氨酸水溶性強(qiáng)，卻不易溶于有機(jī)溶劑，是大蒜中特有的含硫氨基酸，根據(jù)蒜氨酸的結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)，可以通過直接、間接等多種方法檢測大蒜中蒜氨酸的含量。目前，傳統(tǒng)的檢測方法存在專一性相對較差、準(zhǔn)確度較低的問題，定硫法專屬性較差，薄層色譜掃描法是半定量檢測方法，茚三酮法的準(zhǔn)確度較低，高效毛細(xì)管電泳法由于蒜氨酸無高波長紫外吸收使得檢測的靈敏度較低；而GC-MS法有很好的專屬性，但蒜氨酸為強(qiáng)極性化合物，無法直接氣化，在檢測之前要對蒜氨酸樣品進(jìn)行衍生化處理，因此，該法的使用也受到了一定的限制[19]。

蒜氨酸的極性特點(diǎn)更適宜采用液相色譜手段進(jìn)行檢測，HPLC法的專屬性、檢測結(jié)果更可靠、準(zhǔn)確，因而被廣泛應(yīng)用。夏陳等[20]用高效液相色譜法測定大蒜中蒜氨酸含量，該試驗(yàn)采用Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相為水+甲醇，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，95%甲醇溶液等梯度洗脫：0～15 min，DAD檢測器，檢測波長214 nm。試驗(yàn)結(jié)果表明：紅七星大蒜中蒜氨酸含量最高，為3.67%，道孚、金蒜一號(hào)、曲Ⅰ中蒜氨酸含量較接近，均在1.70%～1.80%，市售獨(dú)頭蒜中蒜氨酸含量為2.44%，市售大蒜蒜氨酸含量最低，僅為1.58%。該試驗(yàn)測定結(jié)果的重復(fù)性好，精密度高，加標(biāo)回收率較好，為大蒜的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了有效的方法。

3.2 大蒜素的檢測技術(shù)

3.2.1 定硫法

定硫法測定大蒜素的基本原理是大蒜素中的硫代亞砜基被濃硝酸氧化成硫酸根離子，硫酸根離子再與氯化鋇反應(yīng)生成硫酸鋇沉淀，根據(jù)硫酸鋇的重量換算出大蒜素的含量。

3.2.2 色質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS法)

在測定揮發(fā)性大蒜油的色譜方法中，最常用的是GC-MS法。Liliana G等[21]采用GC-MS法對大蒜含硫化合物進(jìn)行了定性研究。采用TG-XLB-MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，以He為載氣，流量為1 mL/min，注射口溫度為250 ℃，分流比20∶20，檢測器溫度為270 ℃，程序溫度設(shè)置：以4 ℃/min從40 ℃升至100 ℃，以4 ℃/min從100 ℃升至150 ℃，以10 ℃/min從150 ℃升至270 ℃；MS條件設(shè)置：電離電壓為70 eV，離子源溫度為200 ℃，掃描范圍為50～450 m/z。GC-MS法具有良好的特異性和高靈敏度，可用于大蒜素中有關(guān)物質(zhì)的定性定量檢測。

3.2.3 高效液相色譜法

液相色譜檢測基本都在常溫下進(jìn)行，克服了大蒜素在氣相色譜中會(huì)產(chǎn)生熱分解的不足，因而液相色譜法得到了廣泛應(yīng)用，是檢測大蒜活性成分較好的選擇。劉蘭等[22]建立了高效液相色譜法測定大蒜愈傷組織中大蒜素含量的分析方法。色譜柱為 Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為35 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水(含0.2%甲酸，80∶20)，進(jìn)樣量為50 μL，流速為1.0 mL/min，二極管陣列檢測器在240 nm波長下測定大蒜素含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，大蒜素在0.30～4.57 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，加標(biāo)回收率為95%～102%。

3.2.4 其他檢測方法

此外，分光光度法、硝酸汞沉淀法等也可以用作大蒜素含量的日常檢測。每種檢測方法都各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，可根據(jù)試驗(yàn)條件選擇適宜的檢測方法對大蒜有機(jī)硫化物的成分進(jìn)行檢測。

4 結(jié)論

大蒜在不同的加工過程中可以產(chǎn)生多種有機(jī)硫化物，這些有機(jī)硫化物具有重要的生物學(xué)活性和藥理活性，是大蒜發(fā)揮功效的主要成分。隨著人們對大蒜功效產(chǎn)品要求的日漸提高，促使著大蒜有機(jī)硫化物的提取工藝不斷改進(jìn)，分析方法不斷提高。無論是對于蒜氨酸還是大蒜素，大蒜中這些有機(jī)硫化物的提取工藝以及準(zhǔn)確檢測手段的發(fā)展都是對于大蒜種植、推廣、開發(fā)的技術(shù)支撐，對于大蒜特色產(chǎn)品的開發(fā)和醫(yī)學(xué)藥用具有重要的意義。