周艷，羅楓，伍世鋼，阮君

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院(清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院)病理科，廣東 清遠(yuǎn) 511518

隨著人們健康體檢意識的提高及超聲診斷技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)甲狀腺小結(jié)節(jié)而進(jìn)行手術(shù)的病例逐年增加，而甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤。對甲狀腺手術(shù)標(biāo)本中進(jìn)行病理檢查，因病變微小或形態(tài)學(xué)不典型，僅僅通過常規(guī)HE染色進(jìn)行病理診斷具有一定的困難。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是PTC局部復(fù)發(fā)的主要因素，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移將增加治療的難度。為了進(jìn)一步診斷疾病、判斷預(yù)后，本研究觀察了免疫組化法檢測甲狀腺過氧化物酶(TPO)、間皮細(xì)胞(HBME-1)、細(xì)胞角蛋白19(CK19)、半乳糖凝素-3(Galectin-3)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)在PTC與良性病變中的表達(dá)水平，探討其在PTC與良性病變鑒別診斷中的價(jià)值以及CyclinDl與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間的關(guān)系，為診斷及預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院2012—2018年甲狀腺手術(shù)病例(甲狀乳頭狀癌和甲狀腺良性病變)533例，均由兩名主治醫(yī)師以上職稱的病理診斷醫(yī)生根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。533例病例中包括甲狀乳頭狀癌(PTC)269例(其中乳頭狀微小癌103例)，年齡14～79歲，中位年齡44歲；女性220例，男性49例；單側(cè)PTC231，雙側(cè)PTC 36例，單側(cè)合并峽部PTC 2例。余264例為病理組織形態(tài)學(xué)需與PTC鑒別的甲狀腺良性病變(BTL)(出現(xiàn)局部濾泡上皮乳頭狀增生，濾泡上皮細(xì)胞具有非典型性)。其中包括甲狀腺濾泡增生162例，濾泡性腺瘤81例，橋本甲狀腺炎21例(橋本合并PTC 7例，濾泡性腺瘤合并PTC 3例)。PTC行TPO、CK19、HBME-1標(biāo)記269例，CyclinD1標(biāo)記205例，Galectin-3標(biāo)記209例。良性甲狀腺病變TPO、CK19標(biāo)記 264例，HBME-1標(biāo)記253例，CyclinD1標(biāo)記201例，Galectin-3標(biāo)記202例。

1.2 研究方法 取石蠟包埋組織，然后進(jìn)行切片，其厚度為3 μm；其中一張切片行HE染色，其余切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。免疫組化采用EnVision二步法，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用已知的陽性切片作陽性對照。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) 觀察TPO、CK19、HBME-1、Galectin-3、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺良性病變組織中的表達(dá)。由兩名以上主治醫(yī)師及以上職稱的病理診斷醫(yī)師進(jìn)行結(jié)果判讀。陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：TPO、CK19胞膜及胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，Galectin-3胞漿著色，HBME-1胞膜著色，CyclinD1胞核著色。按陽性細(xì)胞所占百分比判斷，TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1陽性細(xì)胞大于10%為陽性，否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的五種檢測標(biāo)記物比較 PTC組的HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1陽性表達(dá)率明顯高于甲狀腺良性病變組，而TPO陽性表達(dá)率明顯低于甲狀腺良性病變組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 5個(gè)指標(biāo)在乳頭狀癌與良性病變中的表達(dá)情況［例(%)]

在免疫組化切片TPO在PTC中呈陰性或局灶弱陽性，正常甲狀腺呈強(qiáng)陽性，良性病變中多呈中-強(qiáng)陽性。HBME-1在PTC多呈細(xì)胞膜連續(xù)性的中-強(qiáng)表達(dá)，在良性病變中陰性或局部弱陽性。CK19、Galectin-3在PTC多呈強(qiáng)表達(dá)，在良性病變中多呈陰性，部分良性病變?nèi)?中度或局灶的強(qiáng)表達(dá)。CyclinD1在多數(shù)PTC病例中呈核彌漫著色，在良性病變中多數(shù)呈局部核著色。TPO乳頭狀癌陰性表達(dá)，橋本甲狀腺炎陽性表達(dá)(圖1)。HBME-1乳頭狀癌陽性表達(dá)，橋本甲狀腺炎陰性表達(dá)(圖2)。CyclinD1乳頭狀癌陽性表達(dá)(圖3)。CK19乳頭狀癌陽性表達(dá)(圖4)。

圖1 TPO左下乳頭狀癌陰性表達(dá)，右上橋本甲狀腺炎陽性表達(dá)(×40)

圖2 HBME-1左下乳頭狀癌陽性表達(dá)，右上橋本甲狀炎陰性表達(dá)(×40)

圖3 CyclinD1在乳頭狀癌陽性表達(dá)(×40)

圖4 CK19在乳頭狀癌陽性表達(dá)(×40)

2.2 淋巴轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移組患者的CyclinD1比較 CyclinD1標(biāo)記PTC 205例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組55例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組150例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的CyclinD1表達(dá)水平分別為92.7%(51/55)、88.0%(132/150)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.55，P＞0.05)。

2.3 標(biāo)記物的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度 TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1在PTC診斷的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值見表2。其中TPO特異性和陽性預(yù)測值最高。CK19、Galectin-3靈敏度和陰性預(yù)測值最高，TPO、HBME-1、Galectin-3均表現(xiàn)較高的準(zhǔn)確度。

表2 5種標(biāo)記物的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值比較(%)

3 討論

近年來，甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病趨勢呈全球化激增，其中甲狀腺乳頭狀微小癌所占比重逐漸上升[1]。PTC的診斷主要是依據(jù)病理形態(tài)學(xué)腫瘤細(xì)胞核的特點(diǎn)，包括毛玻璃樣核、核溝和核內(nèi)假包涵體，還可出現(xiàn)間質(zhì)纖維組織反應(yīng)、鈣化及砂粒體。然而很多早期PTC形態(tài)學(xué)不典型，甲狀腺乳頭狀微小癌≤1.0 cm，有些病變甚至小于0.2 cm，無典型乳頭狀結(jié)構(gòu)，鏡下僅表現(xiàn)為大量膠原纖維中分布著散在的濾泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞異型性不明顯，給PTC的診斷提出了很高的挑戰(zhàn)和要求。在良性甲狀腺病變中亦可見到乳頭狀增生的上皮或是豐富密集的濾泡，出現(xiàn)細(xì)胞的不典型性，核增大、毛玻璃樣核、核溝等。因此部分病例單純從病理形態(tài)學(xué)方面來鑒別甲狀腺良惡性存在一定困難。

TPO是一種糖基化血紅素蛋白，主要存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞游離面，是甲狀腺激素合成通路中的重要物質(zhì)，在T4和T3合成中起重要的催化作用。TPO基因的一些突變可能與甲狀腺癌的發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)通過免疫組化方法檢測TPO在正常甲狀腺組織中表達(dá)，而在PTC中為陰性或弱陽性，在良性病變中多呈現(xiàn)中等至強(qiáng)陽性表達(dá)。在PTC中TPO表達(dá)缺失達(dá)84.0%，在良性病變僅6.1%缺失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)中報(bào)道一致[2-3]。本研究TPO的特異度達(dá)93.94%，陽性預(yù)測值達(dá)93.39%。有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為TPO陰性表達(dá)是PTC診斷的可靠依據(jù)[4]。人骨髓內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(HBME-1)為單克隆抗體，是間皮細(xì)胞微絨毛表面特異性標(biāo)記物，在腫瘤血管的形成、腫瘤的生長以及腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。以往常被用于間皮來源腫瘤的診斷，但是近些年被用于PTC的診斷中。HBME-1在PTC中高表達(dá)，在良性病變中不表達(dá)或局灶表達(dá)，對PTC靈敏度、特異性均較高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。HBME-1陽性表達(dá)對PTC的確診具有重要意義[6-7]。CK19是一種低分子量上皮標(biāo)記，主要存在于單層上皮中。近來應(yīng)用于PTC的診斷中。本研究發(fā)現(xiàn)CKl9診斷PTC的靈敏度最高，與文獻(xiàn)[8]中報(bào)導(dǎo)一致。CK19在PTC表達(dá)的陽性率為100.00%，且均為彌漫強(qiáng)陽性，在良性病變的陽性率為44.3%，多為局部陽性。CK19對PTC和良性病變的鑒別診斷靈敏度最高100.00%，但特異性最低僅55.56%。CK19的陰性預(yù)測值為100.00%，因此有研究[9]認(rèn)為CK19陰性基本可除外PTC的診斷。Galectin-3是一種和β-半乳糖苷結(jié)合的內(nèi)源性凝集素，在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間起特異性黏附作用。具有多種生物學(xué)功能，如參與前mRNA剪接、細(xì)胞生長調(diào)控、細(xì)胞粘附、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[10]。本實(shí)驗(yàn)顯示Galectin-3在PTC中多呈陽性，在良性增生病變陰性或局部陽性，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致[11]。Galectin-3鑒別甲狀腺良惡性腫瘤靈敏度為98.56%。有研究將免疫組化應(yīng)用于甲狀腺細(xì)針穿刺標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)Galectin-3和CK19也診斷PTC最敏感的標(biāo)記物[12]。甲狀腺乳頭狀癌組CyclinDl蛋白表達(dá)高于甲狀腺良性病變組，提示細(xì)胞增殖在甲狀腺惡性腫瘤中增快。有早期觀察發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的PTC其獨(dú)特的免疫組織化學(xué)表型為p27表達(dá)的缺失及cyclin D1的高表達(dá),cyclin D1陽性表達(dá)等因素是PTC出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后較差的危險(xiǎn)因子[13]。此外，也有一些研究發(fā)現(xiàn)CyclinDl蛋白的表達(dá)與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)聯(lián)性[14-15]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)不盡相同，待下一步更大樣本量及更多臨床病理因素的分析。有大量觀察顯示PTC出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素包括：男性、發(fā)病年齡＜45歲、腫瘤大?。? mm、甲狀腺外浸潤、雙側(cè)病變、多灶性、BRAF(V600E)突變、人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)突變陽性、病理分期3期/4期[16]。

本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)PTC組患者TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1的陽性表達(dá)率與B TL組患者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1用于PTC診斷時(shí)的靈敏度分別是84.01%、86.62%、100.00%、98.56%、89.26%，特異性分別是93.94%、86.56%、55.56%、73.76%、71.14%；CyclinD1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以上研究結(jié)果說明TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1在PTC與良性病變中的表達(dá)差異顯著，認(rèn)為免疫組化技術(shù)是診斷PTC非常必要的手段。

綜上所述，PTC的診斷及鑒別診斷中，在病理組織形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上，檢測TPO、HBME-1、CK19、Galectin-3、CyclinD1可提高PTC的確診率，有效避免漏診及誤診。