張 榮，徐丹丹，姜焰鳴，江立群，習平根，陳厚彬，姜子德

(1 華南農業(yè)大學 園藝學院，廣東 廣州 510642； 2 深圳職業(yè)技術學院 應用化學與生物技術學院/博士后創(chuàng)新實踐基地，廣東 深圳 518055； 3 華南農業(yè)大學 工程基礎教學與訓練中心，廣東 廣州 510642；4 華南農業(yè)大學 農學院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642)

荔枝霜疫病由荔枝霜疫霉Peronophythora litchii引起，是造成荔枝果實褐變腐爛、產量降低和產量不穩(wěn)定的主要病害，在我國荔枝栽培區(qū)普遍發(fā)生[1-2]；該病為害荔枝新梢、嫩葉及花穗，在氣候條件適宜發(fā)病的年份，可引起荔枝產業(yè)經濟損失高達80%以上，嚴重限制了荔枝產業(yè)的發(fā)展[3]。

關于荔枝霜疫霉對溫濕度適應性的研究多為溫度或者濕度單獨對荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)和侵染的影響，Chen等[4]研究臺灣地區(qū)的荔枝霜疫霉在V8汁培養(yǎng)基中，菌絲生長的溫度范圍為8～32 ℃，最適生長溫度為24～28 ℃；Liu等[5]研究華南地區(qū)的荔枝霜疫霉在PDA培養(yǎng)基中，菌絲生長溫度為12～32 ℃，最適生長溫度為 28～30 ℃；蔡學清等[6]研究認為在24～28 ℃條件下，果實最易被荔枝霜疫霉侵染且發(fā)病最重；黃河等[7]認為荔枝霜疫霉孢子囊遇水立即脫落。荔枝霜疫病的發(fā)生和流行與日照時數(shù)、降雨天數(shù)有關，日照時數(shù)和降雨天數(shù)直接影響果園的溫度和寄主露時，連續(xù)降雨數(shù)天即可造成該病害流行，且病害來勢兇猛，一旦發(fā)生便迅速擴展蔓延[8]。因此，監(jiān)測種植區(qū)環(huán)境條件，結合物候期對病害發(fā)生進行有效的預測預報，在其發(fā)病前期和初期采取有效的防治措施，對遏制病害的流行為害至關重要。Montone 等[9]通過監(jiān)測草莓葉片露時得到相應的預測模型應用于草莓病害的預警系統(tǒng)中；Roubal等[10]依據(jù)降雨量、溫度及相對濕度等環(huán)境因素預測Fusicladium oleagineum對橄欖的侵染及潛伏期；Uysal等[11]探索了溫度、露時及葉齡對菠菜炭疽病菌侵染及擴展的影響。而有關荔枝霜疫病發(fā)生的流行條件、預測預報方法等報道較少[12]。

農作物病蟲害預測預報是植物保護工作的基礎，是實現(xiàn)防災減害的重要保證。本研究在人工控溫、控濕條件下，研究溫度、露時(即寄主濕潤持續(xù)時間)對荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)和侵染的影響，以期為荔枝霜疫病監(jiān)測預警提供依據(jù)，提高預測預報準確性。

1 材料和方法

1.1 材料

葉片和果實接種試驗選取的荔枝品種均為‘懷枝’。

荔枝霜疫霉菌株(編號SHS3)由華南農業(yè)大學植物病理學系真菌研究室分離、鑒定和保存。菌株培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 溫度和露時對孢子囊萌發(fā)的影響 葉片和果實上孢子囊萌發(fā)的觀察參考蔣繼志等[13]的方法并稍作改動：選取長勢一致的嫩葉和成熟果實置于保鮮盒中，將玻璃紙剪成均等大小 (2 cm×2 cm)，于無菌水中浸濕后附著于葉片或果實表面；然后吸取10 μL 的孢子囊懸浮液 (1×104mL?1)滴于玻璃紙上，每個葉片或果實滴5滴，將葉片或果實分別放置在15、20、25和30 ℃條件下培養(yǎng)，待達到相應的露時2、4、8、12 和 24 h 后，置玻璃紙于載玻片上，在顯微鏡下觀察孢子囊的萌發(fā)情況。每個處理設置3次重復，每次重復至少計數(shù)100個孢子囊。

1.2.2 溫度和露時對葉片和果實感病的影響 荔枝葉片的接種方法參考Neufeld 等[14]和Arauz 等[15]的方法并稍作改動。將孢子囊懸浮液噴霧接種于嫩葉上，至有液滴滴落。荔枝果實的接種方法：取新鮮的荔枝成熟果實用清水清洗后晾干，將果實在孢子囊懸浮液中浸泡1 min后取出。

將接種過的葉片分別于15、20、25和30 ℃條件下培養(yǎng)，接種過的果實分別于20、25和30 ℃條件下培養(yǎng)，待達到相應的露時 2、4、8、12和24 h后，用強風吹干葉片和果實，重新置于各自的培養(yǎng)溫度下，24 h后將所有的處理移至白天24 ℃、晚上 20 ℃、12 h 光暗交替、75%～90% 相對濕度下繼續(xù)培養(yǎng)7 d。每天觀察葉片或果實的發(fā)病情況并記錄發(fā)病等級，計算接種3 d的病情指數(shù)。每個處理設置3次重復，每次重復至少接種50片葉片或30顆果實。

葉片發(fā)病分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占葉片面積的1%～25%；2級，病斑面積占葉片面積的26%～50%；3級，病斑面積占葉片面積的51%～75%；4級，病斑面積占葉片面積的75%以上。

果實發(fā)病分級標準參考Qu等[16]的方法并稍作修改。0級：果皮未出現(xiàn)病斑；1級：病斑面積占整個果皮面積的5%以下；3級：病斑面積占整個果皮面積的6%～15%；5級：病斑面積占整個果皮面積的16%～25%；7級：病斑面積占整個果皮面積的26%～50%；9級：病斑面積占整個果皮面積的50%以上。

病害發(fā)生嚴重度計算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)模型擬合

模型擬合采用SAS(9.4版本)軟件進行分析。在Neufeld等[14]分析方法的基礎上略作修改，首先用初步方差分析法分析孢子囊萌發(fā)試驗的3組重復、孢子囊侵染葉片試驗的3組重復、侵染果實的2組重復是否有明顯差異，若無明顯差異，后續(xù)則取各組重復試驗的平均值進行分析。其次對孢子囊在葉片、果實上萌發(fā)及侵染試驗分兩步進行分析，第一步使用SAS中的PROC GLM過程分析比較溫度 (θ)、露時 (t)以及它們的交互效應 (θ×t)對孢子囊萌發(fā)和寄主發(fā)病嚴重度的影響；第二步則以方程f(t,θ) ={1?exp[?(B×t)2]}/cosh[(θ?F)×G/2] 擬合模型。該模型是韋布爾函數(shù)的修正式，其中斜體小寫字母為自變量，大寫斜體字母為參數(shù)。B代表變量y響應自變量露時(t)的固有增長率，F(xiàn)和G分別代表變量y響應最佳溫度和溫度(θ)的固有變化率。使用SAS中的PROC NLIN過程，將孢子囊平均萌發(fā)率和寄主平均發(fā)病嚴重度分別擬合至非線性模型。使用SAS PROC REG過程分析孢子囊萌發(fā)率和寄主發(fā)病嚴重度觀察值和預測值的相關性，評估模型擬合的可靠性。根據(jù)參數(shù)估計的顯著性、漸近標準誤差的大小評估模型的擬合優(yōu)度，使用MATLAB MESH制作孢子囊在葉片、果實上萌發(fā)和侵染的三維曲面圖。

1.4 病害風險預測模型

通過擬合模型f(t,θ)產生t和θ的函數(shù)，預測發(fā)病嚴重程度。根據(jù)最終模型參數(shù)估算溫度和露時的范圍，使用 MATLAB CONTOUR 制作等高線圖，預測荔枝嫩葉和成熟果實霜疫病發(fā)生的嚴重度。

2 結果與分析

2.1 孢子囊萌發(fā)及寄主發(fā)病程度響應溫度和露時的方差分析

方差分析結果(表1)表明孢子囊萌發(fā)、孢子囊侵染嫩葉和孢子囊侵染成熟果實響應溫度和露時的重復試驗之間的差異不顯著(P＞0.05)，因此可使用試驗數(shù)據(jù)平均值進行后續(xù)分析。溫度、露時極顯著影響孢子囊的萌發(fā)及葉片、果實接種3 d后的病害嚴重度(P＜0.000 1)；溫度和露時的交互作用也可以顯著影響孢子囊的萌發(fā)及寄主發(fā)病的嚴重度(P＜0.01)。

表1 溫度和露時對荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)及荔枝葉片、果實發(fā)病程度影響的方差分析Table 1 Analysis of variance for the effects of temperature and wetness duration on sporangia germination of Peronophythora litchii and disease severities of litchi leaf and fruit

2.2 不同溫度和露時對孢子囊萌發(fā)的影響情況

荔枝霜疫霉孢子囊在溫度為15～30 ℃時，露時為2 h時即開始萌發(fā)，且萌發(fā)率隨著露時的延長而逐漸增大；在溫度為25 ℃時，所有露時處理條件下的孢子囊萌發(fā)率達到最大值。孢子囊在葉片上萌發(fā)率大于0.2的溫度為25 ℃，露時≥2 h或溫度20 和 30 ℃，露時≥4 h(圖1A)；在果實上孢子囊萌發(fā)率大于0.6的溫度為20和30 ℃，露時≥12 h或溫度 25 ℃，露時≥8 h(圖1C)。

圖1 不同溫度和露時處理下荔枝霜疫霉孢子囊在荔枝葉片和果實上的萌發(fā)率Fig. 1 Sporangia germination rates of Peronophythora litchii on litchi leaf and fruit under the conditions of different temperature and wetness duration

2.3 不同溫度和露時對葉片和果實發(fā)病程度的影響

露時相同的條件下，當溫度為25 ℃時，孢子囊為害荔枝嫩葉和成熟果實最為嚴重；所有的溫度處理下，葉片和果實的發(fā)病程度隨著露時延長而加重。相同的處理條件下，孢子囊為害果實比葉片更為嚴重和迅速(圖2)。荔枝葉片接種孢子囊后，溫度為 25 ℃，露時≥2 h 時，病害嚴重度可達 0.2；或者溫度為 20 或 30 ℃ 時，露時≥4 h；而溫度為 15 ℃時，則需露時≥12 h(圖2A)。果實接種孢子囊后，溫度為 25 ℃、露時≥2 h 或者溫度為 20 和 30 ℃、露時≥4 h，果實的病情指數(shù)即可超過0.6(圖2C)。

圖2 荔枝葉片和果實接種荔枝霜疫霉孢子囊3 d后的病情指數(shù)Fig. 2 Disease severity of litchi leaf and fruit at three days after inoculation with Peronophythora litchii sporangia

2.4 模型的參數(shù)估計和檢驗

選用韋布爾模型的修正式，在SAS軟件中擬合得到了準確度較好的孢子囊萌發(fā)和發(fā)病嚴重度模型f(t,θ) ={1?exp[?(B×t)2]}/cosh[(θ?F)×G/2]。模型很好地描述了溫度和露時對荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)和侵染的影響。孢子囊萌發(fā)率和病害嚴重度隨露時變化呈S形曲線，隨溫度變化呈單峰形曲線(圖1B、1D和圖2B、2D)。模型擬合的漸進參數(shù)估計值均有效且差異顯著(P＜0.05)，近似標準誤差均較小(表2)。

從預測值和觀測值相關性分析來看，孢子囊對葉片和果實萌發(fā)率的預測值和觀測值差異不顯著(P＞ 0.05)，即可認為預測值與觀測值無差異，模型擬合效果較好，其決定系數(shù)(r2)分別為0.931 2和0.948 4；孢子囊侵染葉片和果實病害嚴重度的預測值和觀測值差異不顯著(P＞0.05)，即可認為預測值與觀測值無差異，模型擬合效果較好，決定系數(shù)分別為 0.814 7 和 0.991 6(表3)。

2.5 病害風險預測

根據(jù)荔枝嫩葉和成熟果實接種孢子囊3 d后的病害嚴重度的模型，制得相應的風險預測等高線圖(圖3)。依據(jù)荔枝霜疫霉侵染葉片風險預測圖可以推算出病害嚴重度從0.1～0.9變化所對應的溫度和露時。當溫度為 22～30 ℃、露時約為 3～24 h 時，葉片的病害嚴重度達到0.2以上(圖3A)。依據(jù)侵染果實風險預測圖可以推算出病害嚴重度從0.5～0.9變化所對應的溫度和露時。由圖3B可知，荔枝霜疫霉為害果實更易成災，當溫度為15～30 ℃、露時約2～3 h時，果實發(fā)病的嚴重度高達0.6。因此，在荔枝果實接近成熟時，必須嚴格監(jiān)控溫度和露時，及時發(fā)布霜疫病發(fā)生流行的預警信息。

表2 模型參數(shù)估計1)Table 2 Parameter estimates for the model

表3 模型檢驗與擬合公式Table 3 Verification and fitting formula of model

圖3 荔枝霜疫霉侵染荔枝葉片和果實的風險預測圖Fig. 3 Risk prediction charts for Peronophythora litchi infecting litchi leaf and fruit

3 討論與結論

溫度和濕度在病原孢子產生和病害的發(fā)生過程中起著至關重要的作用[17]。據(jù)報道，病原真菌孢子的近距離傳播在一定程度上依賴于局部的溫度和濕度[18]。近年來，多用定量分析模型研究溫度和露時對病原菌孢子萌發(fā)侵染的影響。在卵菌病害的研究中，Arauz等[15]通過定量分析模型研究了溫度和露時對黃瓜霜霉病菌Pseudoperonospora cubensis孢子萌發(fā)和侵染的影響；Rakotonindraina等[19]則結合分析模型研究了不同氣象條件、土質等外界因素影響下馬鈴薯晚疫病菌Phytophthora infestans對馬鈴薯的為害。在果園病害的研究中，Li等[20]定量研究了溫度和相對濕度對梨黑星病菌Venturia nashicola分生孢子萌發(fā)和侵染的影響。本研究在人工控溫、控濕條件下，定量分析了4組溫度 (15～30 ℃)、5 組露時 (2～24 h)對荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)和侵染的影響，利用SAS軟件構建了以溫度和露時為自變量的函數(shù)。并在此基礎上，制得荔枝霜疫霉侵染嫩葉和成熟果實相對應的風險預測圖。在卵菌侵染葉片的試驗中，Neufeld等[14]研究認為病害嚴重度不大于0.1時，為輕度發(fā)病，病害嚴重度為0.1～0.2時屬于中度發(fā)病，不小于0.2則為重度發(fā)病。參考此標準，本研究認為霜疫霉侵染荔枝嫩葉時，當溫度為 22～30 ℃、露時為 3～24 h 時，葉片的病害嚴重度達到0.2以上，認定為嫩葉發(fā)病嚴重，應及時防治。孢子囊為害成熟果實則更加迅速和嚴重，當溫度為 15～30 ℃、露時約 2～3 h 時，果實的病害嚴重度即高達0.6，足可為害成災。

本研究獲得的荔枝霜疫霉侵染荔枝嫩葉和成熟果實的風險預測圖可為實際生產中的荔枝霜疫病預測預報提供參考，但仍存在不足，例如在構建模型后，使用SAS PROC REG過程分析孢子囊萌發(fā)率和寄主發(fā)病嚴重度觀察值和預測值的相關性，認為預測值與觀測值無差異，模型擬合效果較好。模型的準確性，還要結合生產實際中病害發(fā)生流行期的溫度和露時進行進一步驗證。