歐陽錦逵，吳春銀，王裕陽，張成彬，毛子翎，單體江

(華南農(nóng)業(yè)大學 林學與風景園林學院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室, 廣東 廣州 510642)

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungus)是指那些生活史的部分階段或全部生活于健康植物組織或器官內(nèi)部，且在長期的協(xié)同進化過程中與宿主植物形成互惠共生關(guān)系的一類真菌[1-2]。內(nèi)生真菌與宿主植物形成的這種互惠共生關(guān)系為研究者從植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中尋找新型的天然活性先導物提供了新的方向[3]。近年來，內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究越來越受到人們的重視，尤其是從短葉紅豆杉Taxus brevifolia韌皮部分離到產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae后，掀起了人們對內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究的熱潮[4-5]。內(nèi)生真菌作為一種新型的天然活性物質(zhì)資源寶庫，能夠產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物，其具有抗菌、殺蟲、抗氧化、抗腫瘤以及促進植物生長和提高植物抗病性等多種生物活性，從植物內(nèi)生真菌中尋找具有開發(fā)潛能的生物活性物質(zhì)引起了人們極大的興趣[6-9]。

目前對于桉樹內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究多集中在內(nèi)生真菌的生理學和生態(tài)學作用方面。謝安強等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)桉樹內(nèi)生真菌能夠顯著提高桉樹的抗逆能力，如促進植株對磷的吸收能力，提高桉樹的抗寒能力，促進植株的光合作用效能等。Kharwar等[13]從檸檬桉Eucalyptus citriodora中分離得到的曲霉屬Aspergillussp.和毛殼菌屬Chaetomiumsp.內(nèi)生真菌表現(xiàn)出較強的抗真菌和抗細菌活性。格希格圖等[14]從不同桉樹根部分離到的內(nèi)生真菌對桉樹青枯病菌Ralstonia solanacearum有不同程度的拮抗作用，其中以大葉桉Eucalyptus robusta內(nèi)生真菌的抗菌活性最為明顯。Mohali等[15]從桉樹和金合歡Acacia farnesiana中分離到2株新的內(nèi)生真菌Fusicoccumsp.，但并未對其次生代謝產(chǎn)物的生物活性進行研究。華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院森林保護教研室的前期研究表明，窿緣桉Eucalyptus exserta果實內(nèi)生真菌Eef-10表現(xiàn)出較好的抗桉樹青枯病菌活性[16]，本文在前期研究的基礎上，以內(nèi)生真菌Eef-10為研究對象，通過形態(tài)學和分子生物學相結(jié)合的方法確定其分類地位，同時分離和鑒定內(nèi)生真菌Eef-10中的活性成分，并測定其抗細菌和抗腫瘤細胞活性，以期為內(nèi)生真菌資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和腫瘤細胞

內(nèi)生真菌Eef-10分離自健康的窿緣桉果實，目前保藏于華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院植物和微生物健康實驗室。

供試細菌包括大腸埃希菌Escherichia coli(G-)、根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens(G-)、黃瓜角斑病菌Pseudomonas lachrymans(G-)、桉樹青枯病菌Ralstonia solanacearum(G-)和番茄瘡痂病菌Xanthomonas vesicatoria(G-)，以上菌株均保藏于華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院植物和微生物健康實驗室。

供試細胞株系為肝癌細胞(Hep-G2)和宮頸癌細胞(HeLa)，供試腫瘤細胞由中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供。

1.2 儀器與試劑

核磁共振波譜儀 (Bruker Avance-600，美國Bruker公司)，半制備型液相色譜儀(泵：UC-3281，紫外檢測器：UC-3292S，上海Welch公司)，分析型液相色譜儀(LC-10F，天津博納艾杰爾科技有限公司)，三用紫外儀(ZQ-1，上海安亭科學儀器廠)，超凈工作臺(SW-CJ-2G，蘇州凈化設備有限公司)，生化培養(yǎng)箱(LRH-250，上海一恒科技有限公司)。

Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠 (瑞士 GE Heaithcare公司)，GF254薄層層析硅膠和正相柱層析硅膠(青島化工有限公司)，硫酸鏈霉素(w=98%，上海麥克林生化科技有限公司)，噻唑藍(MTT)生物顯色劑(w=98%，美國Amresco公司)，喜樹堿(w≥99%，上海麥克林生化科技有限公司)，真菌基因組DNA抽提試劑盒 [生工生物工程(上海)股份有限公司]，甲醇、二甲基亞砜、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和石油醚(分析純，天津富宇精細化工廠)，甲醇(色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，氘代氯仿、氘代丙酮(巴斯夫化學有限公司)。

1.3 內(nèi)生真菌 Eef-10 的鑒定

采用形態(tài)學和分子生物學相結(jié)合的方法對內(nèi)生真菌Eef-10進行鑒定。

1.3.1 形態(tài)學鑒定 用滅菌牙簽挑取PDA培養(yǎng)基上菌落邊緣生長旺盛的菌絲，接種于新的PDA培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，然后用生物顯微鏡觀察菌絲、有性孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，參照Sekhar等[17]對內(nèi)生真菌Eef-10進行形態(tài)學鑒定。

1.3.2 分子生物學鑒定 參照單體江等[18]的方法對內(nèi)生真菌Eef-10進行分子生物學鑒定。將純化后的內(nèi)生真菌Eef-10(在PDA培養(yǎng)基上生長5 d)接種到 PDB 培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d，分液漏斗過濾后收集菌絲，用液氮進行充分研磨至粉末狀，采用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取其總DNA，使用真菌的通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)擴增其ITS 序列。PCR 反應體系 (50 μL)：去離子水 21 μL，2×TaqPCR MasterMix(含染料)25 μL，ITS4(10 μmol/L)1 μL，ITS5(10 μmol/L)1 μL，模板DNA(10 ng/ μL)2 μL；PCR 擴增程序：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 變性 40 s，56 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸1 min 20 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序成功的ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號。通過在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，使用 MAFTT version 7 處理后，用 MEGA6 軟件采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 內(nèi)生真菌 Eef-10 次生代謝產(chǎn)物的制備

采用大米固體培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌Eef-10進行大規(guī)模發(fā)酵。首先從4 ℃凍存管中挑取少許Eef-10菌絲接種到PDA平板上活化培養(yǎng)5～7 d，再將其菌絲接種在500 mL裝有200 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，置于 28 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 3～5 d。將獲得的液體種子接入已滅菌的大米培養(yǎng)基中，共發(fā)酵 6 kg，28 ℃ 條件下暗培養(yǎng) 60 d，以確保菌絲將大米培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗完畢。而后將發(fā)酵好的固體發(fā)酵物用甲醇冷浸提取3次，每次7 d，減壓濃縮后水混懸，依次用等體積的石油醚和乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚層和乙酸乙酯層粗提物。

1.5 次生代謝產(chǎn)物的分離、純化和鑒定

乙酸乙酯層提取物(51.40 g)經(jīng)減壓硅膠柱層析，先用石油醚洗脫，再用二氯甲烷和甲醇梯度洗脫，通過薄層層析合并成A～D 4個部分。其中B部分(25.19 g)再經(jīng)減壓硅膠柱層析，采用二氯甲烷和甲醇梯度洗脫，通過薄層層析合并成11個餾分，分別編號為 B1～B11。B4餾分 (2.9 g)經(jīng) Sephadex LH-20柱層析(三氯甲烷∶甲醇體積比為1∶1)，通過薄層層析檢測后合并為7個組分，分別編號為B4-1～B4-7。B4-7(30 mg)經(jīng) semi-HPLC(甲醇∶水體積比為 65∶35，流速 5 mL/min，λ= 210 nm，進樣體積為 0.1 mL)制備，得到化合物Ⅰ(4.5 mg)和化合物Ⅱ(5.5 mg)。B6餾分 (9.5 g)，經(jīng) Sephadex LH-20(三氯甲烷∶甲醇體積比為1∶1)柱層析，通過薄層層析檢測后合并成 6 個組分，編號為 B6-1～B6-6。其中 B6-3(95 mg)經(jīng)semi-HPLC(甲醇∶水體積比為 50∶50，流速 5 mL/min，λ= 210 nm，進樣體積為 0.1 mL)制備，得到化合物Ⅲ(30 mg)。

單體化合物的結(jié)構(gòu)主要通過1H NMR、13C NMR等波譜學數(shù)據(jù)進行鑒定，并與文獻比對后確定。

1.6 抗細菌活性的測定

抗細菌活性的測定參照劉志強等[19]的方法，精密稱取單體化合物Ⅰ～Ⅲ各2.0 mg分別溶于0.3 mL丙酮中，再加入0.7 mL蒸餾水，配成質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL的母液，然后用φ為30%的丙酮溶液依次稀釋成質(zhì)量濃度為 2 000.000、1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg/mL 的樣品溶液。陽性對照為硫酸鏈霉素，采用相同的方法配成質(zhì)量濃度為 500.000 00、250.000 00、125.000 00、62.500 00、31.250 00、15.625 00、7.812 50、3.906 25 μg/mL的溶液，備用。在無菌的96微孔板中加入106CFU/mL的供試菌液90 μL，然后加入不同濃度的測試樣品溶液10 μL。同時設空白對照(H2O)和溶劑對照(φ為30%的丙酮溶液)，每處理6個重復。用封口膜將96微孔板四周封口，于28 ℃、黑暗條件下振蕩 (15 r/min)培養(yǎng) 24 h，每孔加入 10 μL MTT 溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，以 3 000 r/min 離心20 min，去上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩 (15 r/min)30 min，為了測定半抑制濃度 (IC50)，多孔板離心后，每孔取 100 μL，于 510 nm下測定吸光度(D510nm)。按下面公式計算待測樣品對供試細菌的抑制率：

所得數(shù)據(jù)采用 Microsoft excel 軟件進行分析，供試樣品濃度取對數(shù)(X)，抑制率換算成概率值(Y)，求得抑制活性回歸方程 (Y= aX+b)和半抑制濃度(IC50)。

1.7 抗腫瘤細胞活性測定

抗腫瘤細胞活性的測定參照Ouyang等[20]的方法，陽性對照為喜樹堿。將對數(shù)生長期細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板(Nest)中，待6～8 h后細胞貼壁。用含有5%(w)FBS(Gibco)的DMEM(Hyclone)細胞培養(yǎng)基將化合物以2倍梯度稀釋，共制備8個梯度(質(zhì)量濃度分別為 80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500、1.250 和 0.625 μg/mL)備用。小心吸棄各孔內(nèi)原生長培養(yǎng)基后，將制備好的各濃度化合物分別加入對應孔中，每孔200 μL，每個化合物每個濃度設置4組重復孔。對照孔加入相應濃度的DMSO。在37 ℃，φ(CO2)為5%條件下，化合物與細胞繼續(xù)共培養(yǎng)48 h。每孔加入CCK8試劑15 μL，在 37 ℃、φ(CO2)為 5% 條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后，采用多功能微孔板檢測儀在450 nm下檢測各孔的吸光度(D450nm)，記錄并保存數(shù)據(jù)。采用GraphPad Prism 5擬合各化合物在各細胞株的生長抑制曲線并計算其IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌 Eef-10 的鑒定

內(nèi)生真菌Eef-10的菌落和顯微形態(tài)如圖1所示。在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈規(guī)則圓形(圖1a)，氣生菌絲發(fā)達，絨毛狀，初始時菌落白色，后期菌落顏色逐漸變灰，且隨時間延長而逐漸加深，培養(yǎng)7 d后可布滿整個培養(yǎng)皿 (d= 7.5 cm)。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲有隔(圖1b)，內(nèi)含多個油滴，菌絲后期顏色較深且粗細不均，隔間距縮短；子囊果近球形(圖1d)，有孔口；附屬絲較長，呈菌絲狀，有隔，周生于子囊果且大部分集中生長于子囊果頂部；子囊孢子灰褐色(圖1c)，單孢，卵圓形，光滑，長×寬平均為7.0 μm×5.5 μm，有頂生萌發(fā)孔；與毛殼菌屬Chaetomium的特征相一致[17,21]。

圖1 內(nèi)生真菌Eef-10的菌落(a)、菌絲(b)、子囊孢子 (c)和子囊果(d)Fig. 1 Colony (a), mycelium (b), ascospore (c) and ascoma (d) of endophytic fungus Eef-10

進一步通過真菌通用引物ITS4和ITS5進行PCR擴增，獲得大小為592 bp的目的序列，將該目的序列提交至GenBank，獲得登錄號MK120863。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，采用最大似然法通過MEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。從圖2可以看出，內(nèi)生真菌Eef-10與Chaetomiumsp.(登錄號：KU504294.1)聚在同一支上，其最大相似度為99.82%，結(jié)合形態(tài)學特征最終將內(nèi)生真菌Eef-10確定為子囊菌門Ascomycota核菌綱Pyrenomycetes糞殼目Sordariales毛殼菌科Chaetomiaceae毛殼菌屬Chaetomiumsp.真菌。

圖2 依據(jù)內(nèi)生真菌 Eef-10 的 rDNA-ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of endophytic fungus Eef-10 based on rDNA-ITS sequence

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

通過1H NMR、13C NMR等波譜學數(shù)據(jù)以及與文獻比對，確定了3種化合物的結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖3 化合物Ⅰ～Ⅲ的結(jié)構(gòu)Fig. 3 The structures of compounds Ⅰ-Ⅲ

化合物Ⅰ，淡黃色固體，1H NMR譜在δH6.20(1H, s)處有 1 個苯基質(zhì)子信號，在δH2.09 (3H,s)和 2.46 (3H, s)處有 2 個苯甲基質(zhì)子信號，在δH3.91 (3H, s)處有 1 個甲氧基質(zhì)子信號，δH12.06(1H, s)和 5.14 (1H, s)表明其結(jié)構(gòu)中含有 2 個羥基信號，而且13C NMR譜中的2個芳香族碳信號δC163.37和158.20進一步支持了苯環(huán)在C-2和C-4處的氧化；通過1H NMR譜的相關(guān)信息及13C NMR 譜δC163.37，158.20，140.39，110.75，108.70，105.46可以推導其結(jié)構(gòu)中含有1個五取代苯環(huán)；13C NMR譜在δ172.83處表明其結(jié)構(gòu)中含有1個羰基?；衔铫竦?H NMR (600 MHz，CDCl3)δH：12.06 (1H，s，2-OH)，6.20 (1H，s，H-5)，5.14 (1H，s，5-OH)，3.91 (3H，s，H-1')，2.45 (3H，s，H-6)，2.10(3H，s，H-3)；13C NMR (151 MHz，CDCl3)δC：172.83(C-7)，163.37 (C-2)，158.20 (C-4)，140.39 (C-6)，110.75 (C-5)，108.70 (C-3)，105.46 (C-1)，52.08 (C-1')，24.36 (C-6)，7.89 (C-3)。上述數(shù)據(jù)與文獻 [22]數(shù)據(jù)一致，故將化合物Ⅰ鑒定為 2, 4?二羥基?3, 6?二甲基苯甲酸甲酯 (Methyl 2, 4-dihydroxy-3, 6-dimethylbenzoate，即 Atraric acid)(圖3a)。

化合物Ⅱ，白色固體，化合物Ⅱ的1H NMR譜和13C NMR譜與化合物Ⅰ數(shù)據(jù)非常接近，基本骨架一致，1H NMR 譜中δH1.40 (t，J= 7.1 Hz，3H)，4.38 (q，J= 7.1 Hz，2H)信號，表明其結(jié)構(gòu)中含有 1 個 R—CH2—CH3信號?；衔铫虻?H NMR (600 MHz，CDCl3)δH：12.14 (1H，s，2-OH)，6.19 (1H，s，H-5)，5.18 (1H，s，5-OH)，4.38 (2H，q，J= 7.1 Hz，H-1′)，2.46 (3H，s，H-6)，2.09 (3H，s，H-3)，1.40 (3H，t，J=7.1 Hz，H-2′)；13C NMR (151 MHz，CDCl3)δC：172.17(C-7)，163.18(C-2)，158.01 (C-4)，140.18 (C-6)，110.53 (C-5)，108.55 (C-3)，105.28(C-1)，61.22(C-1′)，24.23(C-6)，14.26(C-2′)，7.67(C-3)。上述數(shù)據(jù)與文獻[23]數(shù)據(jù)一致，最終化合物Ⅱ鑒定為2, 4?二羥基?3, 6?二甲基苯甲酸乙酯 (Ethyl 2, 4-dihydroxy-3, 6-dimethylbenzoate)(圖3b)。

化合物Ⅲ，無色油狀液體，化合物Ⅲ的1H NMR(600 MHz，Acetone-d6)δH：5.71(1H, s，H-3)，4.32 (2H，t，J= 6.2 Hz，H-6)，2.42 (2H，t，J= 6.2 Hz，H-5)，2.01(3H，s，H-7)；13C NMR (151 MHz，Acetoned6)δC：164.55 (C-2)，159.51 (C-4)，116.95 (C-3)，66.64 (C-6)，29.75 (C-5)，22.87(C-7)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻[24]數(shù)據(jù)基本一致，所以化合物Ⅲ鑒定為4?甲苯?5, 6?二氫?2H?吡喃?2?酮 (4-methyl-5, 6-dihydro-2H-pyran-2-one)(圖3c)。

2.3 抗細菌活性

內(nèi)生真菌Eef-10次生代謝產(chǎn)物對5種供試細菌的抑制活性如表1所示。其中化合物Ⅲ在供試濃度下對5種供試細菌的IC50均大于200 μg/mL；化合物Ⅱ?qū)λ泄┰嚰毦囊种苹钚跃鶑娪诨衔铫?，其中對桉樹青枯病菌的抑制活性最強，其IC50為35.87 μg/mL，與陽性對照硫酸鏈霉素非常接近，其次是對黃瓜角斑病菌和番茄瘡痂病菌的抑制活性，其 IC50分別為 38.91 和 40.80 μg/mL，對大腸埃希菌和根癌土壤桿菌的抑制活性較弱；化合物Ⅰ對黃瓜角斑病菌的抑制活性最強，其IC50為67.25 μg/mL，其次是對番茄瘡痂病菌的抑制活性，其IC50為93.59 μg/mL，而對其他供試細菌的IC50均大于 100 μg/mL。

表1 內(nèi)生真菌Eef-10次生代謝產(chǎn)物的抗細菌活性Table 1 Antibacterial activities of the secondary metabolites isolated from endophytic fungus Eef-10

2.4 抗腫瘤細胞活性

抗腫瘤細胞活性的測定結(jié)果如表2所示，通過GraphPad Prism 5擬合各化合物在各細胞株的生長抑制曲線計算其IC50，除化合物Ⅱ之外，其他化合物對2種腫瘤細胞的IC50均大于50 μg/mL；化合物Ⅱ?qū)eLa細胞的IC50大于50 μg/mL，但對Hep-G2的IC50僅為1.50 μg/mL，明顯強于陽性對照喜樹堿的3.6 μg/mL，表明化合物Ⅱ?qū)ep-G2腫瘤細胞具有較好的生長抑制作用。

表2 內(nèi)生真菌Eef-10次生代謝產(chǎn)物的抗腫瘤細胞活性Table 2 Antitumor activities of the secondary metabolites isolated from endophytic fungus Eef-10

3 討論與結(jié)論

本研究以分離和鑒定抗細菌和抗腫瘤的活性化合物為導向，從窿緣桉內(nèi)生真菌Chaetomiumsp.Eef-10中共分離出3個化合物，包括2個苯酚類和1個戊烯酸內(nèi)酯類化合物。前人的研究表明，化合物Ⅰ(Atraric acid)是一種天然的雄激素受體拮抗劑，主要應用于前列腺癌的治療[25-26]，該化合物曾在地衣植物Parmotrema cooperi[27]、Lecidella carpathica[28]和Pseudevernia furfuracea[22]以及地錢植物Frullania brasiliensis[29]、非洲臀果木Pygeum africanum[23]和紫葳科植物Newbouldia laevis[30]中被發(fā)現(xiàn)和報道，而有關(guān)化合物Ⅱ的研究卻很少，一般是作為Atraric acid衍生物的形式被報道，但化合物Ⅱ?qū)π奂に厥荏w的拮抗作用甚至略高于Atraric acid，亦可作為抗前列腺癌優(yōu)先級的候選藥物[31]。本研究中活性測定的結(jié)果顯示，化合物Ⅱ表現(xiàn)出較好的抗細菌活性，其中對桉樹青枯病菌的抑制活性最強，IC50為35.87 μg/mL，與陽性對照結(jié)果相當，且化合物Ⅱ?qū)ep-G2腫瘤細胞也具有較好的抑制作用，研究結(jié)果為尋找抗桉樹青枯病菌天然微生物源活性藥物提供了新的思路。

致謝：感謝華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院謝輝和徐春玲老師在內(nèi)生真菌形態(tài)學鑒定方面提供的幫助！