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        粘液性銅綠假單胞菌的藥敏現(xiàn)狀及同源性分析

        2020-01-17 02:23:56朱峰
        浙江臨床醫(yī)學(xué) 2019年12期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        朱峰

        銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是醫(yī)院感染中一種重要的革蘭陰性非發(fā)酵病原菌,其中粘液性PA 因其形態(tài)、培養(yǎng)及生物被膜形成等方面的特點(diǎn)[1],在臨床致病和感染治療上具有獨(dú)特性。但因?yàn)槟壳芭R床相對(duì)較低的檢出,導(dǎo)致無(wú)論是實(shí)驗(yàn)室還是臨床對(duì)粘液性PA 的重視程度不夠,其體外藥敏檢測(cè)和臨床治療缺乏規(guī)范。為了解該菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性情況以及在本院的臨床分布,為該菌的臨床防治提供依據(jù),作者對(duì)本院2018 年臨床檢出的粘液性PA 的分離情況及藥敏數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析,并采用腸桿菌基因間重復(fù)共有序列PCR(ERIC-PCR)進(jìn)行菌株同源性分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 資料與方法

        1.1 菌株來(lái)源 研究菌株分離自2018 年1 月至12 月期間本院住院患者細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本,PA 達(dá)324 株,其中粘液性PA 31 株(非重復(fù)分離)。標(biāo)本類(lèi)型包括:痰液、支氣管灌洗液、血液、清潔中段尿、傷口分泌物、腹腔引流液等。本次實(shí)驗(yàn)藥敏檢測(cè)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853。

        1.2 主要儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)菌株的鑒定采用BD 公司生產(chǎn) Phoenix-100 型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀。非粘液性PA的藥敏檢測(cè)采用BD Phoenix 100 及配套藥敏卡;粘液性PA 的藥敏檢測(cè)全部采用紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B),藥敏紙片由英國(guó)OXOID 公司生產(chǎn),分離培養(yǎng)基哥倫比亞血瓊脂平板和藥敏檢測(cè)培養(yǎng)基MH 瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖公司。菌株同源性分析采用美國(guó)Bio-RAD 公司生產(chǎn)的全自動(dòng)熒光定量PCR 儀反應(yīng)體系進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)中使用的Taq 酶及配套試劑由日本TaKaRa 公司生產(chǎn),同源性檢測(cè)擴(kuò)增引物ERIC2 均由上海生工生物有限公司合成。

        1.3 細(xì)菌分離與鑒定 所有實(shí)驗(yàn)菌株的臨床分離純化均依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)程》(第三版)操作。菌種的鑒定按照Phoenix-100 型全自動(dòng)微生物分析儀標(biāo)準(zhǔn)操作指南,先挑取待鑒定實(shí)驗(yàn)菌株單個(gè)菌落,使用含4.5%NaCl 的無(wú)菌水調(diào)制菌液至0.5 麥?zhǔn)蠞岫?,使用BD 配套的細(xì)菌鑒定卡片進(jìn)行菌種鑒定。粘液型PA在哥倫比亞血平板上,37℃環(huán)境下,培養(yǎng)18~24h,菌落呈現(xiàn)為水滴樣、無(wú)色透明、不溶血的小菌落,易漏檢。48h 后逐漸形成溶血性不明顯、膠凍樣、粘稠的菌落,接種環(huán)常不易挑起,油鏡下為革蘭氏陰性桿菌,有類(lèi)莢膜樣物質(zhì)包裹菌體,氧化酶有時(shí)可為陰性,非粘液性PA 無(wú)此現(xiàn)象。粘液型PA 的鑒定和藥敏時(shí)間以培養(yǎng)48~72h 為準(zhǔn)[2]。藥敏結(jié)果判斷依據(jù)CLSI 2018 標(biāo)準(zhǔn)。

        1.4 同源性檢測(cè)方法 采用煮沸法進(jìn)行PCR 模板制備,將ERIC-PCR 反應(yīng)溶液(去離子水9μl、RTaq DNA 聚合酶反應(yīng)體系12.5μl、引物ERIC2 1.5μl 和模板2μl)25μl,放置于PCR 儀中,擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4min,隨后94℃下變性40s、再40℃退火1min、接著72℃延伸5min,需運(yùn)行40 個(gè)循環(huán),最后在72℃下延伸10min 結(jié)束。ERIC-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳成像后,根據(jù)與Marker 的對(duì)應(yīng)位置,具有相同圖譜的視為相同基因型,具有不同圖譜的視為不同。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 菌株數(shù)據(jù)的整理和處理采用WHONET5.6 分析軟件,運(yùn)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行抗菌藥物敏感性的統(tǒng)計(jì)分析,敏感率的比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 粘液性PA 分離情況 2018 年度本院從臨床非重復(fù)分離菌株共3326 株,其中PA 為324 株(9.74%),粘液性PA 為31 株,占比為9.57%。

        2.2 粘液性PA 臨床分布 31 株臨床分離的粘液性PA 來(lái)源主要集中于下呼吸道標(biāo)本,其中痰液29 例、支氣管灌洗液1 例、尿液1 例。主要來(lái)源于呼吸內(nèi)科(67.7%)、ICU(9.7%)、急診內(nèi)科(6.5%)、消化內(nèi)科(6.5%)、門(mén)診(6.5%)和感染科(3.1%)。

        2.3 粘液性PA 和非粘液性PA 敏感性差異比較 見(jiàn)表1。

        表1 粘液性PA和非粘液性PA敏感性差異比較(%)

        2.4 粘液性PA 同源性分析 31 株粘液性PA 經(jīng)ERIC-PCR 基因分型,主要分為A、B、C、D 4 型,其中A 型20 株,B 型5 株,C 和D 型各3 株。部分菌株ERIC-PCR 分型圖譜如圖1 所示。

        3 討論

        圖1 部分實(shí)驗(yàn)菌株ERIC-PCR分型圖譜。注:M為DNA Marker;泳道1、2、3、6、7、8、9、10、12菌株為A型;泳道5、11菌株為B型;泳道4菌株為C型。

        本資料結(jié)果顯示,2018 年本地區(qū)粘液性PA 檢出31 例,占比為9.57%。非粘液型PA 通常不產(chǎn)生粘液和生物膜,但在缺少磷酸鹽、氯化鈉含量較多、高滲透壓等環(huán)境下非粘液型PA 易轉(zhuǎn)化為粘液型。因此,對(duì)于粘液性PA 的形成條件和檢出率的動(dòng)態(tài)關(guān)注,也尤為重要。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,31 例粘液型PA 主要來(lái)自痰液等呼吸道標(biāo)本,其科室來(lái)源于呼吸科和重癥監(jiān)護(hù)等呼吸道疾病集中病區(qū)。這也進(jìn)一步證實(shí)了本菌與呼吸道疾病間的相關(guān)性。也有較多報(bào)道[3-4]顯示,粘液型PA 在慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺炎患者標(biāo)本中檢出率高。這可能與粘液型PA引起的感染清除較困難,容易反復(fù)有關(guān)。由于產(chǎn)粘液型PA 的粘液減少和阻斷了細(xì)菌的外界營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),使該菌生長(zhǎng)明顯減慢,一般需要48h 才能生長(zhǎng),并且在生理鹽水中不容易形成均勻的菌懸液,導(dǎo)致在使用自動(dòng)化儀器鑒定和藥敏試驗(yàn)時(shí),無(wú)法鑒定或者結(jié)果不準(zhǔn)確。因此對(duì)于產(chǎn)粘液型PA的鑒定應(yīng)該在儀器鑒定的基礎(chǔ)上,再結(jié)合菌落形態(tài)和附加生化反應(yīng)加以確認(rèn)。其藥敏檢測(cè)應(yīng)當(dāng)選擇>48h生長(zhǎng)菌落,采用標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行[2]。但目前國(guó)內(nèi)較多微生物實(shí)驗(yàn)室由于人員配備少、工作量繁重以及認(rèn)識(shí)不夠等因素,對(duì)于粘液型PA 的檢測(cè)和報(bào)告缺乏規(guī)范性,甚至和非粘液性PA 根本不做區(qū)分,從而給臨床治療帶來(lái)諸多困難。

        由于粘液性PA 不易形成均勻菌懸液的特點(diǎn),導(dǎo)致在使用儀器藥敏檢測(cè)時(shí),藥敏卡片上各抗菌藥物檢測(cè)孔中菌液濃度分布不均,引起藥敏檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差,而紙片法使用較為直觀的瓊脂擴(kuò)散方法,避免了菌液濃度不均引起的誤差。本資料結(jié)果表明31 株粘液性PA 對(duì)目前臨床常用抗假單胞菌藥物如亞胺培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦和環(huán)丙沙星的敏感性明顯高于同時(shí)期臨床分離的非粘液性PA。雖然粘液性PA 對(duì)臨床常用抗假單胞菌藥物具有較好敏感性,但目前在治療粘液型PA 引起的感染時(shí),臨床治療效果不佳,這主要可能是因?yàn)檎骋盒訮A 表面的脂蛋白、纖維蛋白、藻酸鹽等多糖蛋白復(fù)合物,包裹在細(xì)菌周?chē)尺B成膜狀物,即生物被膜,這種生物膜處于類(lèi)凝膠狀態(tài),目前較為統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物可以抑制和破壞生物被膜,作為聯(lián)合用藥使用時(shí)具有較好療效[5]。

        粘液性PA 因其易定植的生物學(xué)特性,常能夠引起醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生,尤其容易在如呼吸科、老年康復(fù)、ICU 等病區(qū)發(fā)生克隆傳播,因此對(duì)其實(shí)施及時(shí)的監(jiān)控相當(dāng)必要。作者運(yùn)用ERIC-PCR 方法對(duì)本院粘液性PA進(jìn)行了同源性分析,發(fā)現(xiàn)31 株粘液性PA 的基因型主要為A 型,具有較高的同源性,說(shuō)明可能存在院內(nèi)的克隆傳播。其原因可能與臨床的隔離消毒、無(wú)菌操作、侵入性診療等密切相關(guān)。因此采用確實(shí)有效的措施對(duì)于預(yù)防和控制此類(lèi)病原菌的院內(nèi)傳播與感染至關(guān)重要。

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