林巾雄 趙華軍 劉倫銘

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，是造成女性死亡的第二大癌癥［1］，目前以手術(shù)、化療、放療及內(nèi)分泌治療為主。氟維司群為乳腺癌內(nèi)分泌治療的一線用藥，長期用藥通常導(dǎo)致獲得性耐藥問題。因此，耐藥問題已成為治療腫瘤的一大障礙。有研究表明，中西醫(yī)結(jié)合能顯著提高治療效果，減少化療藥物所帶來的耐藥問題，減少放療、化療的副作用，延長患者生存期［2］。在氟維司群耐藥細(xì)胞中，EGFR 異常升高［3］，而同時抑制EGFR 和c-ABL 能有效抑制氟維司群耐藥細(xì)胞的生長。研究表明，EGFR 可能是四逆湯一個潛在的作用靶點［4-5］。作為溫陽法的代表方，四逆湯藥理作用廣泛。眾多研究表明［6-7］，四逆湯能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞的增殖。因此，作者旨在探索四逆湯聯(lián)合伊馬替尼（c-Abl 抑制劑）能否有效抑制氟維司群耐藥細(xì)胞的生長及其誘導(dǎo)凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株來源 人乳腺癌T47D 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥品與試劑 四逆湯組成藥物制附片、干姜、炙甘草，均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)杭州濱江中醫(yī)門診部。氟維司群（Fulvestrant）、伊馬替尼（Imatinib），美國Sigma-Aldrich 公司；新生牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；青霉素、鏈霉素，生工生物工程有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）（1 ∶250），美國Gibco 公司；碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMSO，美國Sigma 公司；Annexin Ⅴ/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，BD 公司；Bid（#1008-1）、Bcl-xl（#2764）、Bcl-2（#2870）、GAPDH（#5174）、β-tubulin（#2128）、HER2（#4290），美國Cell Signaling Technology 公司；PR（sc-538），美國Santa Cruz 公司；ER（#1115-1），美 國abcam 公 司；Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies（二抗），Cell Signaling Technology公司；ECL 顯影液，BIO-RAD 公司。

1.3 方法 （1）MTT 法檢測細(xì)胞生長抑制實驗：取對數(shù)期生長的耐藥細(xì)胞T47D/Ful，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種至96 孔板，每孔加入100μl 細(xì)胞懸液，并控制其細(xì)胞濃度為3000 個/孔，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h 至貼壁后，每孔加入10μl 藥物，設(shè)置系列給藥梯度（四逆湯：10mg、15mg、20mg，生藥25mg/ml，伊馬替尼：15μm、20μm），每個濃度設(shè)置4 個副孔，另外設(shè)置空白對照組，每孔加入10μl培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h 后，每孔加入20μl MTT 溶液，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中，4h 后每孔加入200μl 三聯(lián)液，將96 孔板放至外用37℃恒溫培養(yǎng)箱中作用18h 后，用Bio-Rad 酶標(biāo)儀在570nm 時測定吸光度OD 值，最后計算細(xì)胞的相對存活率以及相對抑制率。（2）聯(lián)合指數(shù)及等效線分析法：將MTT 法計算得到的細(xì)胞存活率以及對應(yīng)的藥物濃度用聯(lián)合用藥軟件CompuSyn 分析四逆湯與伊馬替尼聯(lián)合用藥的聯(lián)合指數(shù)（Combination Index，CI），并生成等效線圖。CI 指數(shù)定義如下：＞1，拮抗作用；=1，疊加作用；＜1，協(xié)同作用。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)期生長的氟維司群耐藥乳腺癌細(xì)胞T47D/Ful，消化、離心后，調(diào)整細(xì)胞濃度（8×105個細(xì)胞），接種至6cm 皿，18h 后至細(xì)胞貼壁，設(shè)置對照組、給藥組（伊馬替尼組：20μm，四逆湯組：25mg 生藥/ml，四逆湯、伊馬替尼聯(lián)合組），加入藥物作用48h 后，收集細(xì)胞，將收集后的細(xì)胞用1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，分別吸取100μl 細(xì)胞懸液至EP 管中，加入FITC-Annexin V 和7-AAD 避光各染10min。最后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。（4）Western Blot 檢測相關(guān)蛋白：取對數(shù)期生長的氟維司群耐藥乳腺癌細(xì)胞T47D/Ful 接種至6cm 皿（8×105個細(xì)胞），待細(xì)胞貼壁后，隨機分組為對照組、四逆湯組（生藥25mg/ml）、伊馬替尼組（20μM）、四逆湯聯(lián)合伊馬替尼組，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，各組加入細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30min，12000r/min、10min，收集上清液、按照碧云天BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，接下來將處理后的蛋白上樣，用SDS-PAGE 分離目標(biāo)蛋白，然后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜，將封閉后的蛋白條帶用Bid、Bclxl、Bcl-2、GAPDH 等一抗孵育過夜，加入對應(yīng)的二抗溶液，孵育2h，ECL 顯影液顯影、化學(xué)發(fā)光儀曝光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計方法。計量資料以（）表示，各組間數(shù)據(jù)的比較采用t 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T47D/Ful 耐藥細(xì)胞敏感性及相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的鑒定 本實驗中所用的氟維司群耐藥乳腺癌細(xì)胞T47D/Ful 由人乳腺癌細(xì)胞T47D 經(jīng)過氟維司群藥物壓力篩選，并采用0.5μm 氟維司群培養(yǎng)約1 年時間得到。作者在實驗展開前對其氟維司群敏感性以及相關(guān)蛋白表達(dá)進行鑒定。實驗結(jié)果顯示（見圖1），耐藥細(xì)胞T47D/Ful相較于親代細(xì)胞T47D，其對氟維司群的敏感性顯著降低，且耐藥細(xì)胞ER、PR 以及HER2 均為陰性表達(dá)，表明本研究中所用的T47D/Ful 細(xì)胞具有氟維司群耐藥細(xì)胞ER、PR 以及HER2 均為陰性的特點，可用于后續(xù)的研究。

圖1 T47D/Ful對氟維司群敏感性及ER、PR和HER2蛋白表達(dá)鑒定（A：T47D/Ful耐藥細(xì)胞相較于親代細(xì)胞對氟維司群敏感性顯著下降。B：T47D/Ful耐藥細(xì)胞呈現(xiàn)ER、PR及HER2三陰性表達(dá)）

2.2 四逆湯與伊馬替尼單獨用藥及聯(lián)合用藥對氟維司群耐藥細(xì)胞T47D/Ful 增殖的影響 實驗結(jié)果顯示（見圖2），四逆湯聯(lián)合伊馬替尼能顯著抑制耐藥細(xì)胞T47D/Ful 的生長，圖3A 顯示，四逆湯生藥25mg/ml、伊馬替尼20μm 劑量下，具有最佳的聯(lián)合效果，且聯(lián)合用藥相較于單獨用藥具有顯著性差異；圖3B 顯示，在四逆湯生藥25mg/ml、伊馬替尼20μm 劑量下，具有最小的CI 值，CI＜1，表明此劑量下具有最佳的協(xié)同效果。

圖2 四逆湯聯(lián)合伊馬替尼對耐藥細(xì)胞T47D/Ful的生長抑制作用（A：MTT法測定四逆湯和伊馬替尼對T47D/Ful細(xì)胞的生長抑制作用。B：聯(lián)合指數(shù)及等效線分析法顯示，四逆湯聯(lián)合伊馬替尼能協(xié)同抑制耐藥細(xì)胞T47D/Ful的生長）

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測四逆湯與伊馬替尼作用后氟維司群耐藥細(xì)胞T47D/Ful 凋亡情況 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，實驗結(jié)果顯示（見圖3A、B），四逆湯及伊馬替尼單獨及聯(lián)合作用于T47D/Ful 細(xì)胞均能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而相較于單獨用藥，聯(lián)合用藥能更加顯著地誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，聯(lián)合用藥能有效誘導(dǎo)氟維司群耐藥細(xì)胞T47D/Ful 凋亡。

2.4 Western Blot 檢測四逆湯與伊馬替尼作用后T47D/Ful 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 Western Blot 結(jié)果顯示（見圖3C），Bid 蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2、Bcl-xl 蛋白表達(dá)水平下降，表明四逆湯聯(lián)合Imatinib 抑制氟維司群耐藥細(xì)胞T47D/Ful 生長是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。

圖3 四逆湯與伊馬替尼單獨、聯(lián)合作用對耐藥細(xì)胞T47D/Ful凋亡的影響及凋亡相關(guān)蛋白Bid、Bcl-xl、Bcl-2的表達(dá)情況（A、B：四逆湯聯(lián)合伊馬替尼能顯著上調(diào)耐藥細(xì)胞T47D/Ful的凋亡比例。C：四逆湯聯(lián)合伊馬替尼能顯著上調(diào)耐藥細(xì)胞Bid的表達(dá)、下調(diào)Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)）

3 討論

近些年來，隨著對中藥研究的深入，中藥在抗腫瘤方面日益展現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢。現(xiàn)代研究表明，四逆湯具有提高免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進腫瘤細(xì)胞凋亡等作用［7］。作為一個ER 拮抗劑，氟維司群（Fulvestrant）在乳腺癌內(nèi)分泌治療中起著重要作用［8］，然而在長時間的治療后，目前大部分患者均產(chǎn)生了耐藥性。而研究表明［9-10］，氟維司群內(nèi)分泌治療失敗后，目前尚無有效方法治療氟維司群耐藥的乳腺癌。因此，尋找新的途徑治療氟維司群耐藥乳腺癌，是目前乳腺癌治療亟待解決的問題。

Liu 等［3］研究表明，用拉帕替尼（Lapatinib，EGFR 抑制劑）和伊馬替尼（Imatinib，c-Abl 抑制劑）能有效抑制氟維司群耐藥細(xì)胞FRBC 的生長，且FRBC細(xì)胞呈類三陰性性狀，即ER、PR 及HER2 均為陰性表達(dá)。因此，為了研究四逆湯聯(lián)合伊馬替尼是否也能抑制氟維司群耐藥細(xì)胞T47D/Ful 的生長，作者首先通過MTT 實驗、聯(lián)合指數(shù)及等效線分析法發(fā)現(xiàn)四逆湯聯(lián)合伊馬替尼能協(xié)同抑制氟維司群耐藥細(xì)胞T47D/Ful 的生長。

隨后，作者對四逆湯聯(lián)合伊馬替尼抑制耐藥細(xì)胞T47D/Ful 生長的機制進行研究。發(fā)現(xiàn)四逆湯聯(lián)合伊馬替尼能顯著誘導(dǎo)T47D/Ful 細(xì)胞凋亡比例的升高，且聯(lián)合用藥組相較于單獨用藥組具有顯著性差異，表明四逆湯聯(lián)合伊馬替尼的效果優(yōu)于單獨用藥。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過程，其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡主要是通過調(diào)節(jié)Bcl-2 家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的平衡、調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示，四逆湯聯(lián)合伊馬替尼能顯著誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bid 的表達(dá)、抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl 和Bcl-2的表達(dá)。

本研究通過系列實驗，初步探究了四逆湯聯(lián)合伊馬替尼對氟維司群耐藥乳腺癌細(xì)胞T47D/Ful 的作用及機制，闡明了四逆湯聯(lián)合伊馬替尼能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而協(xié)同抑制耐藥細(xì)胞T47D/Ful 的生長。這為臨床治療氟維司群耐藥乳腺癌提供了一種新的治療策略與思路，對于四逆湯聯(lián)合伊馬替尼抑制氟維司群耐藥細(xì)胞生長的作用是否存在其它調(diào)控機制，有待本課題組進一步研究。