李峰 馬權(quán) 陳永良 李東章 李王堅(jiān)

前列腺癌是歐美男性發(fā)病率第一，病死率第二的惡性腫瘤［1］。在國(guó)內(nèi)前列腺癌近年來(lái)呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)［2］。目前，前列腺癌的診斷主要依靠血清前列腺特異抗原（PSA）、直腸指診以及前列腺穿刺活檢。PSA 在前列腺癌的早期診斷中起著重要作用［3］，但PSA 水平在前列腺良性疾病及增生時(shí)也會(huì)升高，導(dǎo)致其在早期前列腺癌的診斷中特異性與敏感性均不高［4］，尤其是PSA 在4～10 的灰區(qū)患者中，檢出率僅為25%［5］，且PSA＜10 的患者多為早期患者，前列腺癌干預(yù)效果明顯優(yōu)于進(jìn)展期患者［6］。α-甲酰輔酶A 消旋酶（AMACR）是一種線粒體酶，其蛋白與RNA 在前列腺癌組織中均高表達(dá)［7］，特異性接近100%，敏感性97%，是良好的診斷標(biāo)記物［8］。本研究通過(guò)收集本院穿刺前列腺患者按摩后的尿液進(jìn)行尿沉渣細(xì)胞中AMACR 評(píng)分的分布進(jìn)行研究，探討其在前列腺癌診斷以及PSA 灰區(qū)患者中的診斷作用，旨在建立更高效的無(wú)創(chuàng)診斷模型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2015 年3 月至2017 年3月在本院行前列腺穿刺的PSA 升高患者198 例。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，所有患者均行經(jīng)直腸B超引導(dǎo)下前列腺穿刺活檢術(shù)，穿刺針數(shù)為6～12 針。所有穿刺組織病理均由兩位高年資病理科醫(yī)師一致確認(rèn)。本研究將患者分為兩組，穿刺陽(yáng)性組85 例，穿刺陰性組113 例。198 例樣本臨床信息見表1。

表1 研究人群的臨床和病例特征［n（%）］

1.2 標(biāo)本收集與處理 所有患者行前列腺檢查前由醫(yī)師行前列腺按摩。收集按摩后排尿的初始段尿液約50ml，使用HiPure Total RNA Mini Kit（Magen，China）按說(shuō)明書提取尿沉渣中總RNA。使用Nanodrop 2000微量光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度與純度。使用TransPlex? Complete Whole Transcriptom Amplification Kit（WTA2，SIGMA，USA）全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增試劑盒按說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)尿沉渣中AMACR mRNA 和PSA mRNA 的表達(dá) 使用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo QPK-201，Japan）試劑盒檢測(cè)尿沉渣中AMACR mRNA 與PSA mRNA 的表達(dá)。使用Applied Biosystem StepOnePlusTM Real-Time PCR System進(jìn)行定量檢測(cè)。檢測(cè)數(shù)據(jù)由StepOne Software version v2.1（Applied Biosystem，USA）獲得。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)反應(yīng)。AMACR 表達(dá)量采用評(píng)分方法計(jì)算，AMAMCR 評(píng)分=AMACR mRNA/PSA mRNA×1000=2Ct（PSA）-Ct（AMACR）×1000。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 21.0 與EmpowerStats 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析AMACR 為非正態(tài)分布，使用兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)分析穿刺陽(yáng)性與陰性患者的差異。使用spearman 檢驗(yàn)AMACR 評(píng)分與臨床指標(biāo)相關(guān)性。使用logistics 回歸分析建立AMACR 評(píng)分與血清PSA 的logistics 回歸模型。用受試者工作特征曲線（ROC）確定最佳臨界值、曲線下面積（AUC），對(duì)AMACR 評(píng)分、血清PSA 及兩者聯(lián)用的診斷效能進(jìn)行評(píng)價(jià)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMACR 評(píng)分在前列腺疾病穿刺患者穿刺結(jié)果的預(yù)測(cè)作用 在全部穿刺患者中，前列腺穿刺陽(yáng)性患者的AMACR 評(píng)分明顯高于前列腺穿刺陰性患者（見圖1A，P＜0.001），與血清PSA 結(jié)果相同（見圖1B，P＜0.001）。通 過(guò)Spearman 檢 驗(yàn) 發(fā) 現(xiàn)AMACR 評(píng) 分 與tPSA、fPSA/tPSA、DRE、PSA 密度相關(guān)，與年齡、前列腺體積、Gleason 評(píng)分無(wú)關(guān)（見表2）。使用logistic回歸分析建立血清PSA、AMACR 評(píng)分以及兩者合用的診斷模型。血清PSA 在全部前列腺穿刺患者中的優(yōu)勢(shì)比為5.3（95%CI：0.649～0.793，P=0.037），AMACR在全部前列腺穿刺患者中的優(yōu)勢(shì)比為4.5（95%CI：0.647～0.788，P=0.036）。兩者合用模型方程為：logit（P）=-1.88692 +0.05759*PSA +0.00239*AMACR 評(píng)分。經(jīng)ROC 分析，使用血清PSA，AMACR 以及兩者合用的AUC 分別為0.721、0.717 和0.798。在全部患者中AMACR 評(píng)分與血清PSA 的診斷價(jià)值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.947），兩者合用優(yōu)于血清PSA（P=0.009）或AMACR 評(píng)分（P=0.007）。由此得出，AMACR 評(píng)分在前列腺穿刺患者中有良好的預(yù)測(cè)作用，將AMACR 評(píng)分與血清PSA 聯(lián)用可以明顯提高預(yù)測(cè)總體前列腺穿刺患者穿刺結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 AMACR評(píng)分在全部前列腺疾病穿刺患者穿刺結(jié)果的預(yù)測(cè)作用圖

表2 AMACR評(píng)分與所有患者臨床變量之間的關(guān)系

2.2 AMACR 評(píng)分在PSA“診斷灰區(qū)”的前列腺穿刺患者中的預(yù)測(cè)作用 在灰區(qū)患者中AMACR 評(píng)分與臨床指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)性（見表3）。AMACR 評(píng)分呈非正態(tài)分布，采用兩樣本比較的Mann-Whitney 檢驗(yàn)。在PSA“診斷灰區(qū)”的穿刺患者中，穿刺陽(yáng)性AMACR 評(píng)分明顯高于陰性（見圖2A，P=0.004），而血清PSA 無(wú)法區(qū)分陰性與陽(yáng)性患者（見圖2B，P=0.5210）。在血清PSA4-10 患者中使用logistics 回歸分析血清PSA 與AMAMCR 評(píng)分與PCa 的相關(guān)性，并建立血清PSA 和AMACR 評(píng)分的logistics 回歸模型。血清PSA 在穿刺陽(yáng)性與陰性患者的優(yōu)勢(shì)比為2.3（95%CI：0.407～0.683，P=0.069），AMACR 評(píng)分在前列腺穿刺陽(yáng)性患者和陰性患者的優(yōu)勢(shì)比為4.9（95%CI：0.576～0.820，P=0.062）。經(jīng)AUC-ROC 分析，血清PSA、AMACR 評(píng)分和兩者聯(lián)用曲線下面積為0.545、0.698 和0.707。AMACR 評(píng)分診斷價(jià)值有優(yōu)于血清PSA 的趨勢(shì)，但兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.117）。血清PSA 和AMACR 評(píng)分兩者聯(lián)用相比血清PSA顯示出了更高的臨床診斷價(jià)值（P=0.064）。

表3 AMACR評(píng)分與灰區(qū)患者臨床變量之間的關(guān)系

圖2 AMACR評(píng)分在PSA“診斷灰區(qū)”的前列腺穿刺患者中的預(yù)測(cè)作用圖

2.3 臨床決策曲線評(píng)估診斷模型準(zhǔn)確性 對(duì)全體患者以及灰區(qū)患者進(jìn)行臨床決策曲線評(píng)估，基本模型包含PSA、年齡、fPSA/PSA、DRE 與前列腺體積，通過(guò)比較基礎(chǔ)模型聯(lián)合AMACR 評(píng)分與單用基礎(chǔ)模型的臨床決策曲線發(fā)現(xiàn)，在全體患者中，基礎(chǔ)模型聯(lián)合AMACR評(píng)分在閾值概率＞35%時(shí)患者凈收益優(yōu)于單用基礎(chǔ)模型，獲得最大凈收益，且能夠避免；在PSA 灰區(qū)人群中，基礎(chǔ)模型聯(lián)合AMACR 評(píng)分在閾值概率＞30%時(shí)優(yōu)于單用基礎(chǔ)模型（見表4）。

表4 基本模型和基本模型聯(lián)合AMACR與所有患者相比較的凈收益在相同范圍內(nèi)的不同閾值概率

3 討論

AMACR 研究多局限于腫瘤組織，其在前列腺癌組織中高表達(dá)，其敏感性高達(dá)82%～100%，特異性高達(dá)79%～100%，具有良好的組織診斷學(xué)價(jià)值［8］。但由于組織化學(xué)染色評(píng)分的主觀局限性，不能精確地對(duì)其表達(dá)量與前列腺癌關(guān)系進(jìn)行研究。在組織AMACR的研究中，Al-Maghrebi 等［9］通過(guò)對(duì)前列腺組織中AMACR mRNA 水平的研究發(fā)現(xiàn)，AMACR RNA 的表達(dá)水平，不但能區(qū)分前列腺癌與前列腺良性疾病，同時(shí)也與腫瘤分期與Gleason 評(píng)分相關(guān)。但同時(shí)也有觀點(diǎn)認(rèn)為，在前列腺組織中單獨(dú)使用AMACR 作為診斷標(biāo)記物可能存在誤診的可能，因?yàn)槠湓诹夹韵袤w以及高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（PIN）中也有表達(dá)［10］。Sroka 等［11］研究顯示，尿液中AMACR 蛋白的表達(dá)水平并不能區(qū)分前列腺良惡性疾病，其診斷能效并不優(yōu)于血清PSA。Zielie 等［12］首先使用AMACR 評(píng)分的方法，收集21 例患者的按摩后尿液，對(duì)其AMACR RNA 表達(dá)量進(jìn)行評(píng)分，初步顯示出AMACR 評(píng)分在西方人中的診斷價(jià)值。Ouyang 等［13］通過(guò)將尿液中AMACR RNA 與PCA3 聯(lián)合使用，提高了穿刺陰性患者的前列腺癌檢出率。本研究應(yīng)用AMACR 評(píng)分的方法，評(píng)價(jià)其在中國(guó)人群中的診斷效能。

本研究通過(guò)對(duì)本院穿刺的198 例患者DRE 后的尿沉渣樣本中AMACR 評(píng)分分布進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，AMACR 評(píng)分在總體以及“PSA 診斷灰區(qū)”患者中呈非正態(tài)分布，在全部穿刺患者中AMACR 評(píng)分診斷效能較好，AUC 為0.717，與血清PSA 相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.947），說(shuō)明血清PSA 在前列腺癌診斷中仍有較大價(jià)值。同時(shí)，AMACR 評(píng)分與血清PSA 合用能顯著提高前列腺穿刺患者的診斷能效（AUC=0.798），優(yōu)于血清PSA 與AMACR 評(píng)分單獨(dú)使用（P=0.009、P=0.007）。說(shuō)明應(yīng)用AMACR 評(píng)分與血清PSA 聯(lián)合診斷模型能顯著提高前列腺癌的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

在PSA 4～10 的 灰 區(qū) 患 者 中，血 清PSA 并 不能區(qū)分前列腺良惡性腫瘤，無(wú)明顯的診斷價(jià)值（AUC=0.545）。AMACR 評(píng)分診斷價(jià)值有優(yōu)于血清PSA的趨勢(shì)，但兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.117）。血清PSA 和AMACR 評(píng)分兩者聯(lián)用顯示出了更高的臨床診斷價(jià)值。這個(gè)研究結(jié)果受限于樣本量較小，有待于后續(xù)大樣本量研究進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究的不足為樣本量較小，且為單中心數(shù)據(jù)，在臨床應(yīng)用前還需要大規(guī)模臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)指標(biāo)也僅限于AMACR 評(píng)分與PSA，在下一步的研究中，應(yīng)納入更多的診斷指標(biāo)，以提高該模型的診斷能效。