趙瑋 姜文兵 朱寧 趙旭勇 吳悠揚(yáng)

急性心肌梗死（AMI）是指冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，常并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭，可危及患者生命。目前隨著冠狀動(dòng)脈介入技術(shù)以及器械的快速發(fā)展，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）已成為ST 段抬高的心肌梗死的標(biāo)準(zhǔn)療法。伴隨支架的大量應(yīng)用，支架內(nèi)再狹窄而導(dǎo)致冠脈再次堵塞的事件也隨之頻現(xiàn)，雖然支架已經(jīng)從傳統(tǒng)的裸金屬支架發(fā)展至現(xiàn)在的藥物支架，但是晚期支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生仍是不可忽視的問(wèn)題。目前臨床研究顯示［1］，生物可降解支架的出現(xiàn)可能解決支架植入術(shù)后再狹窄這一問(wèn)題，但是基于目前的臨床研究療效仍然不確切，還需進(jìn)一步改進(jìn)支架或者尋找其它有效藥物治療。支架植入術(shù)后再狹窄的發(fā)生主要是由于支架對(duì)冠脈的損傷刺激平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的增加，最終導(dǎo)致血管堵塞，因此促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡有助于減少支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。以往研究表明［2］百里醌能抑制細(xì)胞增殖從而對(duì)大鼠缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，所以本研究旨在觀察百里醌能否抑制平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移以及其作用的機(jī)制，為臨床應(yīng)用于減少PCI 術(shù)后支架內(nèi)再狹窄奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠購(gòu)自武漢醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，百里醌購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司（廠家：Solarbio）DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco 公司），TRAM-34、胰蛋白酶、MTT（Sigma 公司），兔抗鼠平滑肌α-actin（α-SM A）抗體、S-ABC 過(guò)氧化物酶試劑盒、DAB 顯色試劑盒（上海西唐生物科技有限公司），TRIzol（Invitrogen 公司），Western blot檢測(cè)試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法 （1）頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離及培養(yǎng)：選取250～300g SD 雄性大鼠，腹腔注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉顯效后用手術(shù)刀切開(kāi)頸部皮膚，分離出頸動(dòng)脈放入生理鹽水里漂洗凈血管。用剪刀剪開(kāi)血管，鑷子小心刮去上層的內(nèi)皮細(xì)胞。在20%FBS 的DMEM中用剪刀剪碎平滑肌細(xì)胞層，靜置培養(yǎng)3～4d 后可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞爬出，用PBS 洗3 次后繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿開(kāi)始傳代，傳代3～8 代后細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)。（2）實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施：分離培養(yǎng)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分為空白對(duì)照組、低劑量百里醌組（1mg/L）、中劑量百里醌組（10mg/L）和高劑量百里醌組（100mg/L），除對(duì)照組外，百里醌各劑量組細(xì)胞分別以上述不同濃度的百里醌組進(jìn)行干預(yù)。（3）劃痕實(shí)驗(yàn)觀察平滑肌細(xì)胞遷移情況：取4～7 代頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞置于0.5%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24h 后，用200μl 槍頭在中間劃出一條直線，即在線內(nèi)無(wú)細(xì)胞存在，40ng/ml 血小板衍生長(zhǎng)因子（PDGF）刺激細(xì)胞24h，倒置顯微鏡下觀察載劃痕處細(xì)胞的遷移情況。（4）MTT 法檢測(cè)平滑肌細(xì)細(xì)胞增殖活性：取4～7 代頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞0.5%FBS 的DMEM 培養(yǎng)24h 后，40ng/ml 血小板衍生長(zhǎng)因子（PDGF）刺激細(xì)胞24h，MTT 試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況。（5）細(xì)胞增殖及凋亡檢測(cè)：利用以下染色方法對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)行評(píng)估：①利用α-SMA和PCNA 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖情況；②TUNEL 染色檢測(cè)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡情況，即顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野中凋亡細(xì)胞數(shù)（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)）和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率［凋亡率=（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%］。（6）Western blot 檢測(cè)：用各干預(yù)因素干預(yù)平滑肌細(xì)胞48h 后，按照說(shuō)明書(shū)裂解細(xì)胞，提取總蛋白后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、再孵育，western blot 檢 測(cè)PTEN、P-AKT、AKT、Bax 和Bcl-2蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以（）表示，兩組間的比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 百里醌對(duì)平滑肌細(xì)胞遷移面積的影響 空白對(duì)照組遷移面積為（0.89±0.05）%，低劑量百里醌組遷移面積為（0.67±0.03）%，中劑量百里醌組遷移面積為（0.45±0.03）%，高劑量百里醌組遷移面積為（0.31±0.02）%。與空白對(duì)照組比較，百里醌各劑量組遷移面積明顯減小，遷移面積的縮小呈劑量依賴性變化，即百里醌劑量越大，遷移面積越小，各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 百里醌對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響 MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1），百里醌各組加入不同濃度的百里醌后，與空白對(duì)照組比較，百里醌各劑量組OD 值明顯降低；百里醌各劑量組比較，其OD 值呈劑量依賴性趨勢(shì)改變，即劑量越大OD 值越小，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖2、3），與空白對(duì)照組比較，百里醌各劑量組α-SMA 和PCNA 表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低，百里醌各劑量組α-SMA 和PCNA 表達(dá)陽(yáng)性率也呈劑量依賴性趨勢(shì)改變，即劑量越大α-SMA 和PCNA 表達(dá)陽(yáng)性率越小，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表1）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，百里醌能抑制平滑肌細(xì)胞增殖，且劑量越大作用越明顯。

圖1 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖活性比較

圖2 各組α-SMA免疫組織化學(xué)染色

表1 各組α-SMA和PCNA免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞陽(yáng)性率比較［%，（）］

表1 各組α-SMA和PCNA免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞陽(yáng)性率比較［%，（）］

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與低劑量百里醌組比較，#P＜0.05；與中劑量百里醌組比較，△P＜0.05

組別 α-SMA細(xì)胞陽(yáng)性率 PCNA細(xì)胞陽(yáng)性率低劑量百里醌組 55.64±2.58* 47.42±1.15*中劑量百里醌組 42.98±2.75*# 33.32±1.12*#高劑量百里醌組 30.49±1.12*#△ 19.81±1.36*#△空白對(duì)照組 61.50±1.22 53.08±0.54

2.3 百里醌對(duì)平滑肌細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)各組細(xì)胞TUNEL 染色（見(jiàn)圖4），與空白對(duì)照組比較，低劑量百里醌組和中劑量百里醌組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異（P＞0.05），而高劑量百里醌細(xì)胞凋亡率升高，與其他組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

圖3 各組PCNA免疫組織化學(xué)染色

圖4 各組細(xì)胞TUNEL染色

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較［%，（）］

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較［%，（）］

注：與其它組比較，*P＜0.05

組別 細(xì)胞凋亡低劑量百里醌組 10.14±1.55中劑量百里醌組 9.85±3.97高劑量百里醌組 24.13±3.55*空白對(duì)照組 10.16±1.94

2.4 百里醌對(duì)平滑肌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，百里醌各劑量組的PTEN 和Bax的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，而P-AKT、AKT 和bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組；百里醌各劑量組之間比較，PTEN 和Bax 蛋白的表達(dá)量隨著劑量增大而升高，P-AKT、AKT 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)量隨著劑量增大而降低，各組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖5）。

3 討論

圖5 各組PTEN、P-AKT、AKT、Bax和bcl-2蛋白表達(dá)量比較（注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與低劑量百里醌組比較，#P＜0.05；與中劑量百里醌組比較，△P＜0.05）

成熟動(dòng)物的血管平滑肌細(xì)胞（SMCs）是高分化和高特異性的細(xì)胞，其主要功能是通過(guò)調(diào)節(jié)血管張力和直徑來(lái)調(diào)控血管的收縮和舒張，進(jìn)而控制血壓和血流的分布。通常情況下在成熟血管中平滑肌細(xì)胞極少處于增殖狀態(tài)以及表現(xiàn)出分泌活性［3］，但是在應(yīng)對(duì)血管損傷、炎癥、血流剪切力增加的時(shí)候，平滑肌細(xì)胞受到各種生長(zhǎng)因子比如血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等的刺激而處于活躍的增殖和遷移狀態(tài)，最終促進(jìn)血管重構(gòu)，導(dǎo)致管腔狹窄［4］，進(jìn)一步引發(fā)血管相關(guān)的疾病，如支架術(shù)后再狹窄。

百里醌是黑種草黑籽精油的主要活性成分，主要具有抗炎和抗癌作用。此外研究發(fā)現(xiàn)百里醌具有鎮(zhèn)痛、抗糖尿病、抗組胺作用，能夠緩解呼吸系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等藥理作用［5］。最重要的是百里醌的抗癌活性在多種動(dòng)物模型和腫瘤細(xì)胞株被證明是有效的［6-7］。百里醌能抑制轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的激活，導(dǎo)致人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡［8］。在多發(fā)性骨髓瘤、鱗狀細(xì)胞癌、人類前列腺癌細(xì)胞株中百里醌的抗增殖效應(yīng)主要與抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）有關(guān)。另外有研究顯示，百里醌能通過(guò)增加Bax/Bcl-2 比值促進(jìn)細(xì)胞凋亡和減少腫瘤增生［9］，同時(shí)百里醌也能通過(guò)上調(diào)PTEN 從而抑制下游AKT 的磷酸化來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［10］。PTEN位于人類染色體10q23.3，其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的作用，并與細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白相互作用，抑制細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散和粘附。基于其在多種腫瘤中的高頻率突變，PTEN 被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因。隨后有研究表明PTEN 同時(shí)具有蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶和三磷酸肌醇磷酸酶活性。PTEN 主要通過(guò)抑制PI3K/AKT 通路介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［11］。

以往研究表明PTEN 的上調(diào)能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［12］，AKT1 能通過(guò)FoxO3a 和APAF1促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡從而減緩動(dòng)脈重構(gòu)與動(dòng)脈粥樣硬化。作者在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，高劑量百里醌可使平滑肌細(xì)胞大量凋亡。細(xì)胞遷移和增殖影響檢測(cè)中，均顯示隨著百里醌劑量的加大，其抑制平滑肌細(xì)胞遷移和增殖作用越明顯。同時(shí)劑量的增加對(duì)PTEN/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響越大，高劑量百里醌上調(diào)PTEN 蛋白和下調(diào)P-AKT 蛋白、AKT 蛋白表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白發(fā)現(xiàn)，Bax 蛋白隨劑量增大表達(dá)水平上升，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平下降。通過(guò)以上一系列結(jié)果，作者推測(cè)，百里醌可上調(diào)PTEN 蛋白和Bax 蛋白的表達(dá)，下調(diào)P-AKT 蛋白、AKT 蛋白和Bcl-2 蛋白的表達(dá)，通過(guò)抑制PI3K/AKT 通路活化和提高Bax/Bcl-2 比值，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖、遷移和介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，百里醌能夠抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，其作用機(jī)制與PTEN/AKT 信號(hào)通路活化相關(guān)。然而本研究仍有不足之處，百里醌是由不同成分組成的中藥提取物，想要了解哪些活性成分具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用，仍需進(jìn)一步研究。