徐雯 沈起鈞 單嫣娜 賴旭峰 陳文輝

抑郁是糖尿病的常見并發(fā)癥之一。糖尿病患者的抑郁與亞臨床抑郁癥狀發(fā)生率顯著高于普通人群，且其藥物依從性及血糖控制較差，導致并發(fā)癥的發(fā)生風險升高［1］。慢性應激是抑郁及其它應激相關(guān)情緒障礙的重要發(fā)病因素，其所導致的腦內(nèi)解剖結(jié)構(gòu)、電生理及神經(jīng)化學等多個方面的變化，已被研究證實與糖尿病并發(fā)認知功能障礙模型中觀察到的相關(guān)變化類似［2］，提示慢性應激可能與糖尿病相關(guān)認知障礙及其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有大量研究證明海馬與認知功能密切相關(guān)，且糖尿病及慢性應激刺激均可導致海馬解剖結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元可塑性以及代謝調(diào)控等一系列病理生理變化［3-4］。然而，目前關(guān)于慢性應激刺激背景下糖尿病大腦中海馬的代謝變化情況的相關(guān)報道相對較少。本研究旨在應用核磁共振氫譜（1H NMR）檢測慢性不可預測輕度應激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）對糖尿病大鼠海馬代謝的影響，為糖尿病并發(fā)抑郁的發(fā)病機制研究提供基礎(chǔ)，并為相關(guān)臨床治療提供理論依據(jù)及新思路。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 （1）實驗動物：20 只普通級雄性Wistar 大鼠（6 周），許可證編號：SYXK（浙）2010-0150，體重155.2～168.7g，平均（163.4±3.89）g，每籠4 只。置于安靜舒適實驗環(huán)境，普通飼料飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律光照，平均室溫22℃～25℃，空氣濕度50%～60%，并可自由進食進水。（2）主要藥品、試劑及儀器：Bruker AVANCE III 600 核磁共振譜儀（Bruker BioSpin International AG）；血糖儀（德國貝朗醫(yī)療國際貿(mào)易有限公司）；冷凍干燥機（FD-1，北京德天佑科技發(fā)展有限公司）；勻漿機（上海弗魯克流體機械制造有限公司）；鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）。

1.2 研究方法 （1）動物分組及模型建立：所有大鼠禁食16h 后一次性腹腔注射STZ（溶于新鮮配制的0.1mol/L，pH=4.5 枸櫞酸緩沖液中，4℃保存）64mg/kg。注射后72h 尾靜脈采血測血糖，隨機血糖＞16.7mmol/L 并保持＞3d 即成功建立糖尿病大鼠模型。隨后按隨機數(shù)字表進行分組：糖尿病組（即DM 組，n=6 只）、糖尿病慢性應激組（即DC 組，n=14 只）。將所有DC 組大鼠每日暴露于一種CUMS 方法［5］并持續(xù)4 周，應激包括群居飼養(yǎng)（7 只/籠）、潮濕墊料（500ml/籠）、鼠籠傾斜40°、夾尾1min、頻閃光照（300 flashes/min）6h、白噪音［（80±5）db］6h、4℃冰水游泳5min。DM 組不做處理，每日自由進食進水。CUMS 處理完成后，兩組大鼠進行行為學評估［6］。（2）行為學實驗：包括Open-field 實驗及Morris 水迷宮實驗。Open-field 實驗：將大鼠放入底面劃分成25 個面積相等方格的敞箱正中格，使其自由活動5min 并同時進行攝像和計時。Morris 水迷宮空間探索實驗：直徑1.5m 的圓形水池，平臺直徑0.13m，水深0.3m，水面高出平臺2cm。連續(xù)訓練4d，每次將大鼠貼壁放入水中，觀察并計時60s，若60s 內(nèi)未找到平臺，則引導其至平臺，停留15s。第5 天撤除平臺，將大鼠從距原平臺最遠的象限面壁放入水中，攝像系統(tǒng)記錄大鼠在60s 內(nèi)活動數(shù)據(jù)。（3）海馬組織的制備及1H NMR 檢測：所有大鼠在行為學實驗后斷頭處死，并將收集的海馬組織樣本浸入液氮中急凍，置于-80℃保存。冰凍的海馬組織樣本在提取水溶性的小分子代謝物后，在液氮中冷凍，并放入真空凍干機中凍干24h。將得到的代謝物粉末重新溶解，低溫離心后取上清液，轉(zhuǎn)入NMR 樣品管中進行測試。使用Bruker AVANCE III 600MHz NMR 譜儀采集組織樣本的1H NMR 譜。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況及體重變化 兩組大鼠進食及飲水量增加，體質(zhì)量逐漸下降，明顯消瘦，毛色晦暗，二便增多，DC 組大鼠精神萎靡，反應遲鈍。兩組大鼠于應激前后均始終保持高水平隨機血糖（＞33.3mol/L）。以應激前后大鼠體質(zhì)量作為監(jiān)測指標，兩組大鼠體質(zhì)量均呈下降趨勢，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見圖1）。

2.2 兩組大鼠行為學實驗比較 （1）Open-field 實驗：DC 組大鼠的總路程、活動時間及活動次數(shù)均較DM 組減少（P＜0.05，見圖1）。（2）Morris 水迷宮實驗：在空間探索實驗中，DC 組大鼠的站臺穿越次數(shù)較DM 組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 慢性應激刺激后兩組大鼠體質(zhì)量變化［g，（）］及行為學實驗結(jié)果比較（注：與DM組比較，DC組在Open-field實驗中的活動次數(shù)（a）、活動時間（b）及總路程（c）明顯減少；在Morris水迷宮探索實驗中，DC組的站臺穿越次數(shù)較DM組明顯減少（d）。CUMS處理第0、14、28天，DC組與DM組大鼠體質(zhì)量均無顯著差異。＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.3 兩組NMR 波譜和統(tǒng)計學分析 兩組大鼠海馬的典型1H NMR 波譜圖見圖2。兩組大鼠海馬提取物1H NMR 譜中譜峰的歸屬參照文獻［7］。與DM 組相比，DC 組大鼠海馬中的谷氨酸及谷氨酰胺含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1），其余所測得代謝物于兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1）。

圖2 兩組大鼠海馬的典型1H NMR波譜圖

表1 1H NMR方法分析兩組大鼠海馬中各代謝物含量［mmol/kg，（）］

表1 1H NMR方法分析兩組大鼠海馬中各代謝物含量［mmol/kg，（）］

代謝物 譜峰（ppm） 海馬DM組 DC組 P值Lac δ1.31-1.34 103.49±4.94 101.92±6.34 0.66 Ala δ1.46-1.49 5.52±0.81 6.01±0.41 0.05 NAA δ2.01-2.02 33.60±1.81 34.00±2.13 0.74 GABA δ2.27-2.31 9.39±0.69 9.64±0.35 0.32 Glu δ2.33-2.38 41.61±1.83 44.33±1.41 0.01 Suc δ2.39-2.41 2.90±0.56 3.41±0.60 0.15 Gln δ2.45-2.50 18.66±0.72 19.55±0.66 0.03 Asp δ2.80-2.82 4.07±0.18 4.50±0.54 0.15 Cre δ3.03-3.05 48.57±2.23 48.75±2.01 0.88 Cho δ3.19-3.20 2.22±0.50 2.00±0.35 0.32 Tau δ3.40-3.44 27.35±1.39 27.03±1.73 0.73 Gly δ3.54-3.56 3.31±0.18 3.27±0.24 0.75 m-Ins δ3.60-3.64 32.84±1.53 33.23±1.17 0.59

3 討論

本研究采用一次性腹腔注射STZ 建立糖尿病模型，之后利用CUMS 方法模擬慢性應激環(huán)境，實驗中觀察到兩組大鼠均出現(xiàn)進食及飲水量增加，體重下降，毛色晦暗，二便增多等典型糖尿病癥狀，而DC 組又表現(xiàn)出精神萎靡、反應遲鈍等抑郁樣癥狀。CUMS 方法模擬了日常生活中的慢性應激事件，其已被大量研究證實可使實驗動物產(chǎn)生類抑郁狀態(tài)［5］。Open-field 實驗是基于嚙齒類動物同時有畏懼空曠場地和探究新事物、新環(huán)境的天性，用于評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。本研究中，DC 組大鼠在實驗中的活動總路程、活動次數(shù)及活動時間均較DM 組大鼠明顯減少，反映其對未知環(huán)境的好奇程度及探索能力明顯下降。Morris 水迷宮廣泛用于評價嚙齒類動物空間位置感及方向感的學習及記憶能力。本研究中，DC 組大鼠在第5 天的空間探索實驗中穿越平臺位置的次數(shù)較DM 組明顯減少，表明其對平臺位置及方向的學習記憶能力明顯下降。上述DC 組大鼠的行為學表現(xiàn)與臨床上慢性應激引起的抑郁狀態(tài)患者出現(xiàn)情緒低落、興趣缺失、學習記憶力減退的癥狀相符，進一步驗證了模型的可靠性。

質(zhì)子核磁共振是一種強大的用于研究腦能量代謝、神經(jīng)傳遞和神經(jīng)膠質(zhì)-神經(jīng)元相互作用的方法。離體1H NMR 技術(shù)在檢測靈敏度、區(qū)域特異性和代謝物譜峰的分散方面較在體NMR 技術(shù)有明顯優(yōu)勢。與核磁共振波譜相比，由于離體1H NMR 技術(shù)在超高場強下運行，因此除了可以提供更全面、更準確和更多樣的代謝信息外，亦能對目標代謝物進行絕對定量分析，這有助于更精確的判斷代謝物的變化趨勢。1H NMR 避免了對生物樣品的損傷，減少了分離純化等操作，在不影響其代謝變化的條件下，給出了組織內(nèi)Glu、Gln、GABA、Cre、NAA、Cho、Gly、Asp、Ala、Lac、Tau 等神經(jīng)化學物質(zhì)的信號［7］。

海馬是參與認知能力、近期記憶、學習和注意力的重要腦區(qū)，神經(jīng)影像學研究表明糖尿病及慢性應激均可影響海馬的結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)、突觸可塑性及神經(jīng)電生理等，與認知功能障礙的發(fā)生關(guān)系密切［8-9］。在代謝層面上，以往關(guān)于糖尿病或慢性應激相關(guān)的抑郁所導致的多個腦區(qū)的代謝物變化已有大量報道，但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于慢性應激背景下糖尿病大鼠海馬代謝改變的相關(guān)報道。本研究利用1H NMR 方法進行檢測后發(fā)現(xiàn)慢性應激刺激后的糖尿病大鼠海馬中谷氨酸及谷氨酰胺水平較無慢性應激刺激的糖尿病大鼠明顯增高。這一結(jié)果可能與海馬神經(jīng)元谷氨酸釋放量增加及突觸間隙谷氨酸清除障礙有關(guān)［10-12］。作者認為慢性應激是引起糖尿病大鼠海馬谷氨酸水平升高的重要因素，其可能在糖尿病合并抑郁的發(fā)病過程中起到重要作用。

本研究的不足之處在于缺乏對該過程中海馬神經(jīng)元EAAT 表達情況變化的探究，這也是本課題組下一步的研究方向，即采用RT-PCR 技術(shù)對糖尿病慢性應激大鼠海馬神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT 的核酸表達進行檢測，進一步闡明慢性應激對糖尿病大鼠海馬谷氨酸代謝產(chǎn)生的影響。

綜上所述，本研究運用1H NMR 技術(shù)檢測了慢性應激狀態(tài)下的糖尿病大鼠模型的海馬代謝變化情況，為糖尿病合并抑郁的發(fā)病機制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)及潛在的治療靶點。