樊 英，李 樂，于曉清，胡發(fā)文，李天保，葉海斌，刁 菁

( 山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東 青島 266104 )

鋅是人和動物體內必需的微量元素，分布于不同的組織中[1-5]。納米鋅粒子是粒徑為1～100 nm的顆粒，因其細微化的形態(tài)，作為添加劑使用時更易被接受和吸收，且效果更佳[6-9]。目前，鋅或納米鋅的研究涉及醫(yī)療、衛(wèi)生、運輸、養(yǎng)殖等多個領域，就畜禽養(yǎng)殖業(yè)來說，已在仔豬[10-11]和肉仔雞[12-14]飼養(yǎng)上取得良好效果。應用形式主要是不同形式鋅離子或納米氧化鋅，如適量的納米氧化鋅能不同程度地促進仔雞的生長發(fā)育，從不同方面影響仔雞自身的功能[12-14]。同時，七水硫酸鋅[3]、蛋氨酸鋅[3]、甘氨酸鋅[5]等不同狀態(tài)鋅離子的應用同樣已取得顯著效果，證實鋅在水生動物生長中的重要性。

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)屬鮭形目、鮭科、大麻哈魚屬，現(xiàn)已成為分布國家最多、地區(qū)最廣的養(yǎng)殖魚類之一。在虹鱒養(yǎng)殖過程中多采用高密度集約化方式，條件性致病因素通常易引起魚體損傷、感染、潰爛，進而導致其生長緩慢或產(chǎn)品價值的降低，因此提高虹鱒自身免疫力是亟待解決的問題。而抗生素的廣泛使用或濫用不僅存在藥物殘留問題，還會使致病菌產(chǎn)生耐藥性，進而影響產(chǎn)品的安全質量。目前，關于虹鱒飼料添加劑或免疫增強劑的研究已有報道，如殼聚糖[15]，可從不同方面影響動物自身狀況。納米鋅和納米鋅多糖復合體在虹鱒養(yǎng)殖中的應用鮮見報道。筆者以虹鱒為試驗對象，通過其非特異性免疫指標的變化來研究納米鋅和納米鋅多糖復合體對機體免疫功能產(chǎn)生的影響，旨在為虹鱒飼料添加劑或免疫增強劑的研制開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用鋅為納米鋅及納米鋅多糖復合體溶液(1000、3000 mg/kg)(南京精德豐新材料科技有限公司)，其中鋅為納米級鋅元素，多糖來源于杏鮑菇(Pleurotuseryngii)，1000 mg/kg含鋅187.5 mg、多糖187.5 mg，3000 mg/kg含鋅562.5 mg、多糖562.5 mg。虹鱒取自青島魯海水產(chǎn)技術發(fā)展有限公司。試驗飼料為鮭鱒苗種配合飼料(北京漢業(yè)科技有限公司)，其營養(yǎng)水平見表1。

表1 專用配合飼料基本營養(yǎng)成分含量(干物質基礎) %Tab.1 Approximate composition levels of basal diets (dry basis)

1.2 虹鱒養(yǎng)殖條件

每個平行組試驗魚放養(yǎng)于80 cm×50 cm×60 cm的水族箱中，試驗前用基礎飼料喂養(yǎng)7 d，后續(xù)開始試驗。試驗過程中日換水50%，日投喂量為體質量的2%，投喂時間為10:00、18:00，根據(jù)攝食情況適當調整并飽食投喂。試驗期間水溫為(15.0±2.0) ℃，溶解氧水平為(7.0±0.5) mg/L。

1.3 試驗方法及指標測定

選取平均體質量(120±3.0) g的虹鱒300尾，隨機分成5組(每組3個平行，每個平行20尾)，分別按照1 μL/g分別進行魚體尾部肌肉注射納米鋅及納米鋅多糖復合體(1000、3000 mg/kg)，試驗周期為10 d。對照組注射相同體積的無菌生理鹽水。飼喂試驗結束后，稱量虹鱒體質量(濾紙上靜置30 s后進行)，計算虹鱒特定生長率。

特定生長率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

式中，m1為初始體質量(g)，m2為終末體質量(g)，t為試驗時間(d)。

分別于注射1000、3000 mg/kg不同劑量的納米鋅和納米鋅多糖復合體后1、3、6、9 d取樣，每個平行隨機取3尾魚，自尾靜脈處采血。一部分加入裝有肝素鈉(50 IU/mL)的離心管中，置于4 ℃保存?zhèn)溆茫灰徊糠旨尤? mL離心管后4 ℃放置6 h，5000 r/min離心15 min，取血清置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

殺傷細胞檢測[16]：取0.2 mL抗凝血和0.2 mL 2 g/L四唑硝基藍(NBT)溶液(四唑硝基藍用無菌生理鹽水配制成2 g/L的水溶液，與等量0.067 mol/L pH 6.4磷酸鹽緩沖液混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)于試管中混勻，37 ℃溫育30 min，中間振搖一次，移至室溫下放置15 min，混勻，吸取1滴于載玻片上做成推片，立即吹干，經(jīng)快速瑞氏—姬姆薩染色，油鏡觀察，細胞被染成深紫色或深藍色為NBT陽性細胞。計錄一個視野內NBT陽性細胞百分數(shù)。

白細胞吞噬能力的測定：取混合肝素鈉的血液1滴于潔凈凹玻片的凹孔內，滴加1滴已活化的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)菌液(5×108個/mL)，充分混勻；將凹玻片置于有濕紗布預溫的帶蓋容器內，37 ℃溫育30 min；2000 r/min離心10 min，吸取血漿與紅細胞交界面的白細胞做血涂片，自然晾干；甲醇固定1 min，水沖洗后自然晾干；姬姆薩染色1 min，水沖洗后自然晾干；油鏡下顯微觀察，隨機計數(shù)100個多形核白細胞中吞噬有細菌的細胞數(shù)，即為吞噬百分率(%)。

血清殺菌能力的測定：將殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalraonicida)28 ℃培養(yǎng)24 h活化后，無菌生理鹽水洗滌并調整細菌密度至1×106個/mL；取200 μL新鮮血清與等體積細菌懸液混合，28 ℃溫育1 h；取細菌和血清混合物培養(yǎng)于大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)平板上，28 ℃下培養(yǎng)24 h后計算平板中菌落數(shù)；以0.9%NaCl 溶液菌落形成為對照，計算血清的殺菌百分率：

殺菌百分率/%=(1-n2/n1)×100%

式中，n1為對照平板中菌落數(shù)，n2為試驗平板中菌落數(shù)。

血清中酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合成酶、過氧化氫酶活性，以及微量丙二醛濃度均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。酸性磷酸酶活性單位定義：每100 mL樣品在30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個酶活性單位(U)。超氧化物歧化酶活性單位定義：每毫升樣品在1 mL反應液中超氧化物歧化酶抑制率達到50%時所對應的超氧化物歧化酶量為1個酶活性單位(U)。一氧化氮合成酶活性定義：在提供充足的底物的條件下一氧化氮合成酶每分鐘產(chǎn)生1 nmol一氧化氮所需要的酶量為1個酶活性單位(U)。過氧化氫酶活性定義：每毫升血清每秒鐘分解1 μmol的過氧化氫的量為1個活力單位(U)。微量丙二醛為過氧化脂質降解產(chǎn)物中的成分，間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，濃度單位為nmol/mL。

1.4 攻毒感染試驗

活化后的殺鮭氣單胞菌經(jīng)胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水調整菌液密度為107cfu/mL。試驗結束后，每組隨機抽取10尾虹鱒進行攻毒試驗，經(jīng)肌肉注射0.1 mL殺鮭氣單胞菌稀釋液2次，對照組注射相同劑量的生理鹽水，及時記錄日死亡情況，7 d后結束感染試驗并統(tǒng)計其累積死亡率。按下式計算：

累積死亡率/%=n2/n1×100%

式中，n1為初始魚數(shù)量，n2為累積死亡魚數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行處理和分析，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒生長性能的影響

試驗結束后對虹鱒生長性能進行統(tǒng)計，試驗組虹鱒特定生長率高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)(表2)，可能是由于注射試驗研究時間較短，其生長優(yōu)勢未能體現(xiàn)。但也并非沒有效果，試驗結果顯示，1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組的效果最好。

2.2 納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒血液殺傷細胞數(shù)量的影響

殺傷細胞變化可反映吞噬細胞、中性粒細胞、巨噬細胞的水平和功能，是魚類非特異性免疫指標中的重要因素之一。1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組的激活效果在第3 d最強，殺傷細胞百分數(shù)達到22.3%，其次是1000 mg/kg納米鋅在第6 d的促進效果(19.6%)，均顯著高于對照組(P<0.05)(表3)；而3000 mg/kg納米鋅和納米鋅多糖復合體組對虹鱒血液殺傷細胞數(shù)量的促進效果相對較弱，但仍與對照組差異顯著(P<0.05)；由試驗結果可見，劑量與效果無正相關性。

2.3 納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒血液白細胞吞噬能力的影響

3000 mg/kg納米鋅組虹鱒白細胞吞噬能力第3 d達到最高，為27.36%(P<0.05)，隨時間的延長呈降低趨勢(表4)。3000 mg/kg納米鋅多糖復合體組在第6 d白細胞吞噬能力最高，達39.37%(P<0.05)。

2.4 納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒血清殺菌能力的影響

虹鱒血清殺菌百分率隨給予劑量的增加而提高，3000 mg/kg組血清殺菌百分率均顯著高于1000 mg/kg組(P<0.05)(表5)。3000 mg/kg納米鋅組血清殺菌百分率在第3 d達到最高，為19.4%。3000 mg/kg納米鋅多糖復合體組血清殺菌百分率在第6 d達到最高，為32.43%，與1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒生長性能的影響(平均值±標準誤)Tab.2 Effects of nano-zinc and nano-zinc-polysaccharide compound on growth performance of rainbow trout O. mykiss (mean±SE)

注：相同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05).

Note: means with same superscripts in the same column are not significantly different (P>0.05).

表3 納米鋅及納米鋅多糖復合體對虹鱒NBT殺傷細胞的影響(平均值±標準誤)Tab.3 Effects of nano-zinc and nano-zinc-polysaccharide compound on NBT levels of rainbow trout O. mykiss (mean±SE)

注：不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母代表同行數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)；相同大寫字母表示同行數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05);下同.

Note: means with different small letter superscripts in the same column are significantly different (P<0.05); means with different capital letter superscripts in the same line are significantly different (P<0.05); means with same capital letter superscripts in the same line are not significantly different (P>0.05); et sequentia.

表4 納米鋅及納米鋅多糖復合體對虹鱒白細胞吞噬能力的影響(平均值±標準誤)Tab.4 Effects of nano-zinc and nano-zinc-polysaccharide compound on leukocyte phagocytosis of rainbow trout O.mykiss (mean±SE)

表5 納米鋅及納米鋅多糖復合體對虹鱒血清殺菌能力的影響(平均值±標準誤)Tab.5 Effects of nano-zinc and nano-zic-polysaccharide compound on serum bactericidal activity of rainbow trout O. mykiss (mean±SE)

2.5 納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒血清中非特異性免疫指標的影響

不同劑量的納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒血清非特異性免疫指標產(chǎn)生了影響。過氧化氫酶活性在第3 d達到最高(P<0.05)，為1000 mg/kg納米鋅和納米鋅多糖復合體組，1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組最高(26.39 U/mL)，但兩組間差異不顯著(P>0.05) (圖1a)，第6、9 d活性稍有降低，但不明顯。1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組超氧化物歧化酶在第6 d達到最高(29.91 U/mL)(P<0.05)，納米鋅組在試驗期間變化小，且與對照組差異不顯著(P>0.05)(圖1b)。由圖1a、c可見，超氧化物歧化酶活性越高，其微量丙二醛濃度越低，二者成反比；第6 d 1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組微量丙二醛濃度最低(3.19 nmol/mL)(P<0.05)；第3 d納米鋅多糖復合體組與納米鋅組、對照組差異顯著(P<0.05)。在第3 d，1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組一氧化氮合成酶活性最高(43.38 U/mL)(P<0.05)，第6 d稍有降低；第6 d，1000 mg/kg納米鋅和納米鋅多糖復合體組的一氧化氮合成酶活性差異不顯著(P>0.05)(圖1d)。酸性磷酸酶活性最高值出現(xiàn)在第6 d的1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組，達201.4 U/L，但與3000 mg/kg組納米鋅多糖復合體組間差異不顯著(P>0.05)(圖1e)。

2.6 納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒抗病力的影響

納米鋅和納米鋅多糖復合體不同程度地提高了虹鱒的抗病力。對照組受致病菌殺鮭氣單胞菌感染后，第2 d即出現(xiàn)死亡情況，7 d內累計死亡率高達73.3%；而試驗組在感染后第4 d出現(xiàn)死亡情況，與對照組差異性均顯著(P<0.05)；納米鋅多糖復合體組免疫增強效果相對納米鋅好，1000、3000 mg/kg納米鋅多糖復合體效果差異不顯著(P>0.05)，7 d累計死亡率僅有30%，從感染過程上看，1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組免疫增強效果更好。

3 討 論

3.1 鋅需求對虹鱒機體的影響

鋅元素在養(yǎng)殖動物生長過程中具有重要作用，飼料中鋅缺乏會引發(fā)魚類等養(yǎng)殖動物食欲減退、免疫功能低下等癥狀導致死亡率增高[17]。鋅過量不但會增加飼料成本，影響鈣、鎂、鐵等元素的吸收利用，還會引起養(yǎng)殖水體中鋅含量的增加，進而影響魚類等養(yǎng)殖動物的攝食、生長狀況[18]。因此，飼料中鋅的給予劑量是養(yǎng)殖動物健康生長、養(yǎng)殖環(huán)境優(yōu)化良好的重要保障措施之一[12,19-21]。本研究中通過注射方法給予虹鱒不同劑量的納米級鋅，不同程度地促進了虹鱒特定生長率的提高，增強了虹鱒對致病菌殺鮭氣單胞菌的抵抗能力；然而，大劑量鋅的添加未見異常的負面效果，可能是機體在需求范圍內通過呼吸、排泄等生理過程排出了多余的鋅，Hardy等[22]已通過放射性同位素65Zn證明了這一現(xiàn)象。鋅元素給予的不同形式可導致不同的吸收利用效率，本研究中鋅元素以納米級形式給予，給予量達到最小，提高了體內吸收、轉化效率，促進機體生長。而且，研究中還涉及了免疫佐劑多糖，從試驗結果看，納米鋅多糖復合體的作用效果明顯比納米鋅好，多糖因其特有的結構和功能一方面提高外源添加劑對魚體發(fā)生的促進作用，另一方面可從吸收代謝方面間接輔助機體對鋅源的吸收利用，增強營養(yǎng)和非特異性免疫功能。

圖1 納米鋅及納米鋅多糖復合體對虹鱒血清免疫指標的影響Fig.1 Effects of nano-zinc and nano-zinc-polysaccharide compound on serum immunity of rainbow trout O.mykiss

圖2 殺鮭氣單胞菌攻毒后7 d內虹鱒累積死亡率Fig.2 Cumulative mortality of rainbow trout O.mykiss infected with A.salraonicida within 7 days

3.2 鋅對虹鱒血液殺傷細胞及細胞吞噬功能的影響

細胞免疫在免疫防御過程中發(fā)揮著重要作用。殺傷細胞是魚類細胞免疫指標中的重要因素之一，通過血液中殺傷細胞數(shù)量可反映出吞噬細胞、中性粒細胞、巨噬細胞的水平和功能。黃芪多糖可明顯增加犬齒牙鲆(Paralichthysdentatus)血液中殺傷細胞百分數(shù)[23]；酵母多糖在短時間內同樣可以增加鯉魚(Cprinuscarpio)殺傷細胞陽性細胞數(shù)[16]。本研究中納米鋅和納米鋅多糖復合體組得到類似結果，各試驗組均能促進殺傷細胞陽性細胞數(shù)增加，與對照組差異顯著(P<0.05)，且注射劑量與促進效果之間無正相關性，這與試驗對象、試驗條件及管理等多因素有關，研究中白細胞的吞噬能力與殺傷細胞數(shù)量之間的差異也可能是這些外界因素造成的。

3.3 鋅對虹鱒血清殺菌能力及非特異性免疫指標的影響

鋅作為一種微量元素添加劑具有多重作用，不僅與機體清除自由基的能力、脂質過氧化反應強弱有關，而且與機體蛋白質、脂肪和碳水化合物等物質代謝緊密聯(lián)系；作為磷酸酶等酶活性形式的必要輔助因子，鋅亦可能參與維持酶結構穩(wěn)定和促進酶活性形式轉變的過程[24-25]；這些均與動物機體的健康水平和抗病力有關。因此，本研究中過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、微量丙二醛、一氧化氮合成酶、酸性磷酸酶被用于評價外源納米鋅和納米鋅多糖復合體對虹鱒非特異性免疫功能的影響。結果表明，試驗第3 d，1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組過氧化氫酶、一氧化氮合成酶活性達到最高，分別為26.39、43.38 U/mL；第6 d，超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶活性最高，分別為29.91 U/mL、201.4 U/L，微量丙二醛濃度最低，為3.19 nmol/mL。隨著鋅含量的增加及時間的延長，不同時間獲得了不同的免疫效果，給予量、給予時間、免疫效果之間不存在正相關性。作為機體非特異性免疫指標之一的超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一，常用來評定外界刺激對機體非特異性免疫功能產(chǎn)生的影響，最優(yōu)生長必需的微量元素水平也就是魚類免疫力達到最佳狀態(tài)的水平[26]。納米鋅組超氧化物歧化酶活性在本研究過程中未發(fā)生顯著變化，與對照組無顯著差異，這可能由于試驗對象、試驗條件的限制，虹鱒血清超氧化物歧化酶活性對納米鋅的給予量未達到敏感程度。而在多糖佐劑的促進下，1000 mg/kg納米鋅多糖組超氧化物歧化酶活性在第6 d達到最高，與其他試驗組差異顯著。Onderci等[27]研究表明，在飼料中添加鋅可顯著提高虹鱒的抗氧化功能，與本研究結果一致。Hidalgo等[28]還證實，飼料中缺乏鋅，虹鱒肝超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均顯著降低，這說明鋅對機體抗氧化能力的重要性，也表明超氧化物歧化酶和過氧化氫酶作為評價鋅影響指標的正確性。譚麗娜[29]認為，鋅影響水生動物抗氧化功能的主要原因可能為鋅可參與構成銅—鋅超氧化物歧化酶，還可以誘導合成金屬硫蛋白而抵制自由基的損害。相關深入研究仍在進行。

在虹鱒養(yǎng)殖中，細菌感染是影響經(jīng)濟損失的重要因素之一，非特異性免疫功能的提高是保證養(yǎng)殖效益水平的關鍵。本研究中納米鋅和納米鋅多糖復合體的添加提高了虹鱒血清非特異性免疫功能，間接提高了虹鱒抗殺鮭氣單胞菌感染的能力，推測鋅在虹鱒養(yǎng)殖過程中參與機體免疫酶合成及活性調節(jié)、調控免疫力或代謝水平、影響氨基酸等營養(yǎng)元素，最終提高機體健康水平。

綜上所述，鋅是虹鱒生長和免疫功能達到最佳水平的必需微量元素之一。納米鋅和納米鋅多糖復合體可不同程度地增強虹鱒機體各免疫指標水平，達到提高免疫功能的效果，其中以1000 mg/kg納米鋅多糖復合體組(含鋅187.5 mg、多糖187.5 mg)免疫效果最佳。