王 宇 翕， 蘆 士 杰， 肖 珊,2， 劉 冰 南， 王 際 輝,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.東莞理工學(xué)院 化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院， 廣東 東莞 523808 )

0 引 言

近年來(lái)，隨著刺參養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖密度的不斷增加，殘余餌料、糞便、代謝產(chǎn)物等給養(yǎng)殖環(huán)境帶來(lái)了巨大壓力，造成了刺參的存活率和產(chǎn)量的降低[1]。傳統(tǒng)刺參育苗過(guò)程中，人們通過(guò)頻繁換水來(lái)改善水質(zhì)，但其成本高、持續(xù)時(shí)間短且容易造成刺參的應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)對(duì)刺參生長(zhǎng)造成影響；而使用抗生素則會(huì)使刺參產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)造成抗生素殘留，對(duì)人體造成危害[2]。因此，綠色健康的養(yǎng)殖模式成為刺參養(yǎng)殖業(yè)的當(dāng)務(wù)之急，在養(yǎng)殖中應(yīng)用微生態(tài)制劑越來(lái)越受到認(rèn)可。

水產(chǎn)用微生態(tài)制劑可分為單一菌株微生態(tài)制劑和復(fù)合菌株微生態(tài)制劑兩大類(lèi)。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的有益微生態(tài)制劑主要有芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、酵母菌(Saccharomyces)、光合細(xì)菌(Photosyntheticbacteria)以及硝化細(xì)菌(Nitrifyingbacteria)等[3]。研究結(jié)果表明，乳酸菌和酵母菌等能提供給水生動(dòng)物更多養(yǎng)分，芽孢桿菌則能更好地改善水質(zhì)[4]。

混合發(fā)酵一般指兩種或兩種以上微生物進(jìn)行發(fā)酵的過(guò)程。雖然菌體間的相互作用復(fù)雜，但對(duì)于特定產(chǎn)物的獲得非常重要[5]。研究表明，混合發(fā)酵能夠彌補(bǔ)單一菌株培養(yǎng)時(shí)的缺陷，如純培養(yǎng)過(guò)程中穩(wěn)定生長(zhǎng)期過(guò)后生物量下降，混合發(fā)酵反而能提高菌體生物量。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，混合培養(yǎng)過(guò)程中菌體間的相互作用能抑制菌體生長(zhǎng)，卻能提高菌體的代謝能力[6]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3種菌混合發(fā)酵制備復(fù)合微生態(tài)制劑，前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該復(fù)合微生態(tài)制劑的凈水效果好于單菌和兩種菌混合發(fā)酵制備的復(fù)合微生態(tài)制劑。本實(shí)驗(yàn)確定了3種菌混合發(fā)酵的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，探究其對(duì)刺參養(yǎng)殖水體水質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為復(fù)合微生態(tài)制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、酵母浸粉，生化試劑，北京奧博生物技術(shù)責(zé)任有限公司；黃豆粉，食品級(jí)；蛋白胨、胰蛋白胨均為生化試劑，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 菌 種

芽孢桿菌、乳酸菌，均從大連地區(qū)海泥中篩選得到；酵母菌，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 培養(yǎng)基

芽孢桿菌種子液培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，蒸餾水1 L，pH(6.9±0.1)。

乳酸菌種子液培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO40.05 g/L，乙酸鈉0.5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，MgSO40.2 g/L，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.4。

酵母菌種子液培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，自然pH。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

分別對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化[7]。將3株乳酸菌、2株芽孢桿菌、1株酵母菌種子液等比例接種到不同初始發(fā)酵培養(yǎng)基中(總接種量5%)，在30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，采用稀釋涂布平板法測(cè)定活菌數(shù)。

1.4.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

分別對(duì)接種量、初始pH、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速以及溫度進(jìn)行優(yōu)化[8]。

1.5 刺參養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分空白組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組3組梯度投菌量分別為1、5、10 mL/m3，每組均設(shè)5個(gè)平行；鹽度0.3%，pH 7.5，每缸裝海水20 L，每組投放刺參約30頭，重約200 g。

養(yǎng)殖海水均為自然海水，鹽度0.30%～0.34%，水溫15～25 ℃。第一周為預(yù)飼養(yǎng)，均不投放菌液，適量投餌，讓幼參適應(yīng)環(huán)境。每日下午投餌(17:00)，飼料、海泥質(zhì)量比為1∶2或1∶3，投餌量為刺參質(zhì)量的2%。充氧時(shí)間為每給氧30 min停氧15 min。每日潑灑一次微生態(tài)制劑，在潑灑菌劑前取水樣，測(cè)定水質(zhì)。每3 d換半缸水，每7 d換一整缸水，實(shí)驗(yàn)周期為30 d[9]。

1.6 水質(zhì)指標(biāo)

1.6.1 化學(xué)需氧量(COD)的測(cè)定

取水樣100 mL于250 mL錐形瓶中，加入1 mL 氫氧化鈉溶液搖勻，加入10 mL高錳酸鉀溶液后搖勻；于電熱板上加熱至沸騰，準(zhǔn)確煮沸10 min(從冒出第一個(gè)氣泡時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí))，迅速冷卻到室溫；用定量加液器加入5 mL硫酸溶液，再加入0.5 g碘化鉀，搖勻，于暗處放置5 min。不斷振蕩，用已標(biāo)定的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈淡黃色，加入1 mL淀粉溶液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛褪去，記下滴定數(shù)V1。兩平行樣滴定讀數(shù)相差不超過(guò)0.10 mL；另取100 mL重蒸餾水代替水樣，重復(fù)上述步驟，根據(jù)GB 17378.4—2007分析空白滴定值V2。計(jì)算公式為

式中：COD為水樣的化學(xué)需氧量，mg/L；c為硫代硫酸鈉的濃度，mol/L；V2為分析空白值滴定消耗硫代硫酸鈉的體積，mL；V1為滴定樣品時(shí)硫代硫酸鈉體積，mL；V為水樣體積，mL。

1.6.2 硫化物含量測(cè)定

取一定體積現(xiàn)場(chǎng)采集并固定的水樣于分液漏斗中(樣品應(yīng)確保硫化物沉淀完全，取樣時(shí)應(yīng)充分搖勻)，靜置，待沉淀于溶液分層后將沉淀部分放入10 mL具塞比色管中，加水至6 mL。取2支10 mL具塞比色管，各加入2 mL乙酸鋅-乙酸鈉溶液，加入待測(cè)樣本，沿比色管壁緩慢加入1 mL N，N-二甲基對(duì)苯二胺溶液，立即密塞并緩慢倒轉(zhuǎn)一次，加入0.1 mL硫酸鐵銨溶液，立即密塞并充分搖勻。放置10 min后，在波長(zhǎng)665 nm處測(cè)量吸光度。測(cè)定的吸光度扣除空白試驗(yàn)的吸光度后，參照GB/T 16489—1996計(jì)算硫化物含量。

1.6.3 氨氮含量的測(cè)定

取水樣8 mL于10 mL比色管中，加入1 mL水楊酸顯色劑和2滴亞硝基鐵氰化鈉，混勻。再滴入2滴次氯酸鈉使用液并混勻。顯色60 min后，參照HJ 536—2009測(cè)定697 nm處吸光度。

1.7 水體菌群的測(cè)定

水體菌群采用高通量測(cè)序方法[10]，主要步驟：DNA提取、PCR擴(kuò)增、熒光定量、Miseq文庫(kù)構(gòu)建、Miseq測(cè)序[11]，委托北京諾禾致源公司測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.1.1 碳源優(yōu)化

由圖1可以看出，4種常用碳源葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖中，葡萄糖和淀粉為最佳碳源，其活菌數(shù)為1.42×109和1.31×109cfu/mL。因此，選擇葡萄糖和可溶性淀粉作為最佳碳源。

微課是教學(xué)的輔助資源，要充分發(fā)揮它的功用，必須根據(jù)教學(xué)內(nèi)容，聯(lián)系教學(xué)實(shí)際，科學(xué)地應(yīng)用在教學(xué)活動(dòng)中，突出其實(shí)用性。以培養(yǎng)學(xué)生的平面設(shè)計(jì)能力為核心目標(biāo)的微課學(xué)習(xí)，通過(guò)教師精心設(shè)計(jì)教學(xué)過(guò)程，突出在教師指導(dǎo)下的學(xué)生感悟、探究，可以提升課堂的教學(xué)效果，從而形成符合蘇州高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校實(shí)際的、能促進(jìn)師生共同成長(zhǎng)的課堂教學(xué)模式[3-4]。

圖1 碳源優(yōu)化結(jié)果

2.1.2 氮源優(yōu)化結(jié)果

選擇蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、尿素、硫酸銨5種常見(jiàn)氮源，確定3種菌混合發(fā)酵的最佳氮源。如圖2所示，有機(jī)氮源利用率高于無(wú)機(jī)氮源，這可能是部分菌株產(chǎn)生的蛋白酶，使有機(jī)氮源水解為更容易被利用的小分子化合物。以蛋白胨、牛肉膏為氮源的菌液活菌數(shù)達(dá)1.24×109和1.41×109cfu/mL，高于其他氮源。因而選擇蛋白胨和牛肉膏為氮源。

圖2 氮源優(yōu)化結(jié)果

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化結(jié)果

無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化結(jié)果如圖3所示，分別在去除醋酸鈉、K2HPO4、MnSO4、MgSO4條件下培養(yǎng)，活菌數(shù)僅為對(duì)照組的一半，因而，確定這4種無(wú)機(jī)鹽不可缺少。

圖3 去無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化結(jié)果

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 接種量?jī)?yōu)化結(jié)果

混合菌分別按1%、3%、5%、9%接種，在30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)接種量為9%時(shí)，活菌數(shù)1.6×109cfu/mL最高，因而確定最佳接種量為9%。

圖4 接種量?jī)?yōu)化結(jié)果

2.2.2 初始pH優(yōu)化結(jié)果

2.2.3 裝液量?jī)?yōu)化結(jié)果

在250 mL錐形瓶中分別裝入混合菌液25、50、75、100 mL，在接種量5%、轉(zhuǎn)速180 r/min、25 ℃ 培養(yǎng)2 d。如圖6所示，在裝液量為100 mL時(shí)，活菌數(shù)最高，因而確定每 250 mL裝液100 mL 為最佳裝液量。

2.2.4 轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果

搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為100、150、180、200 r/min，

圖5 初始pH優(yōu)化結(jié)果

圖6 裝液量?jī)?yōu)化結(jié)果

在30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，采用稀釋涂布平板法測(cè)定活菌數(shù)。由圖7可以看出，在200 r/min條件下混合發(fā)酵得到的活菌數(shù)最高，因而確定200 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。

圖7 轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果

2.2.5 溫度優(yōu)化結(jié)果

混合菌分別在初始溫度為20、25、30、35 ℃的發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定其活菌數(shù)。由圖8可以看出，在發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，活菌數(shù)最高，隨著溫度的升高，活菌數(shù)逐漸下降，因而確定25 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖8 溫度優(yōu)化結(jié)果

綜上所述，在針對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化中，確定了葡萄糖15 g，淀粉10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏10 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸三銨2 g，K2HPO40.15 g，MnSO40.05 g，海水1 L，接種量9%，每250 mL裝液100 mL，溫度25 ℃，初始pH 7.0，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。在此條件下測(cè)得活菌數(shù)為3.54×109cfu/mL，是優(yōu)化前的2倍。

2.3 微生態(tài)制劑對(duì)刺參養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

2.3.1 硫化物測(cè)定

如表1所示，該微生態(tài)制劑對(duì)硫化物的清除效果不明顯，清除效果最佳的為5 mL/m3投菌量的實(shí)驗(yàn)組，清除率也僅達(dá)到5.34%。

表1 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)水體中硫化物的影響

2.3.2 氨氮含量的測(cè)定

如表2所示，該微生態(tài)制劑對(duì)于養(yǎng)殖水體有明顯的氨氮清除能力。在第3天時(shí)，投喂1、5、10 mL/m3復(fù)合微生態(tài)制劑的清除率分別為31.5%、40.1%、27.9%，第7天清除率分別為30.1%、38.5%、36.0%，可以看出5 mL/m3投菌量的氨氮清除效果最佳。

表2 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)水體中氨氮的影響

2.3.3 化學(xué)需氧量(COD)測(cè)定結(jié)果

如表3所示，投菌后，實(shí)驗(yàn)組的化學(xué)需氧量的積累顯著低于對(duì)照組，且在第7天清除率分別為23.1%、25.0%、18.5%，表明該微生態(tài)制劑對(duì)COD具有清除能力，且5 mL/m3水體為該復(fù)合微生態(tài)制劑的最佳投菌量。

2.3.4 水體菌群的測(cè)定

如圖9所示，在門(mén)水平上，前期水體的主要菌群結(jié)構(gòu)包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)(圖9(a))。其中變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群。在養(yǎng)殖后期(圖9(b))，水體中變形菌門(mén)增長(zhǎng)，且有少量的疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)出現(xiàn)，疣微菌門(mén)是一門(mén)被劃出不久的菌門(mén)，包括少數(shù)幾個(gè)被識(shí)別的種類(lèi)，主要存在于水生和土壤環(huán)境[12]。劉兵兵[13]在對(duì)水質(zhì)凈化與微生物相互作用關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)對(duì)水質(zhì)有較好的指示作用。該研究發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)的微生物比例增多有利于氨氮的清除，擬桿菌門(mén)微生物比例增多有利于COD的清除。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，養(yǎng)殖水體后期變形菌門(mén)比例增加，可能導(dǎo)致水體中氨氮濃度的降低。同時(shí)，不同投菌濃度下擬桿菌門(mén)比例不同程度下降也與COD清除能力由強(qiáng)到弱一致。武鵬等[14]在養(yǎng)殖水體中潑灑3種微生態(tài)制劑(包括免疫增強(qiáng)劑、復(fù)合芽孢桿菌和EM菌)，結(jié)果表明芽孢桿菌對(duì)水體凈水效果明顯；此外，蓋建軍等[15]選擇EM菌、光和細(xì)菌、乳酸菌和芽孢桿菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究在短時(shí)間內(nèi)養(yǎng)殖水質(zhì)的影響，也證明了芽孢桿菌具有良好的凈水能力。前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該復(fù)合微生態(tài)制劑中芽孢桿菌的比例為80%左右(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。因而，本實(shí)驗(yàn)中復(fù)合微生態(tài)制劑具有的凈水能力與所含有高濃度的芽孢桿菌有關(guān)。

表3 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)水體中COD的影響

(a) 前期

(b) 后期

0,空白組；1,投菌量1 mL/m3；2,投菌量5 mL/m3；3,投菌量10 mL/m3

圖9 養(yǎng)殖水體中投喂復(fù)合微生物制劑前后期的菌群分析

Fig.9 Community analysis of microflora before and after feeding compound probiotic in aquaculture water

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了由6種菌混合培養(yǎng)的復(fù)合微生態(tài)制劑的最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖15 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏10 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，K2HPO40.15 g/L，MnSO40.05 g/L，蒸餾水1 L。接種量9%(每株菌等比例混合)，加液量為每250 mL瓶裝液100 mL，溫度25 ℃，初始pH 7.0，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。得到活菌數(shù)為3.54×109cfu/mL，是優(yōu)化前的2倍。

對(duì)刺參養(yǎng)殖水體的水質(zhì)(氨氮含量、硫化物含量、COD)、水體菌群進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明該微生態(tài)制劑對(duì)硫化物的清除作用不顯著，而對(duì)氨氮含量、COD具有清除作用，清除率最高分別可達(dá)到40.1%和25.0%。在投菌量為5 mL/m3時(shí)，該復(fù)合微生態(tài)制劑有顯著凈水能力。