譚成波

[關(guān)鍵詞]EZH2;lncRNA;燒傷;成纖維細(xì)胞;增殖

肉芽組織形成過程中，需要成纖維細(xì)胞對(duì)組織進(jìn)行調(diào)節(jié)形成收縮[1]。在創(chuàng)傷愈合過程中，成纖維細(xì)胞形成第一次轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉±w維細(xì)胞，在后期瘢痕增生中起到重要作用[2-4]，成纖維細(xì)胞內(nèi)部屬性的變化與生長因子和細(xì)胞因子有一定的相關(guān)性[5-6]。lncRNA主要是對(duì)合成過程中激活、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗M(jìn)行調(diào)控[7-8]，其可通過啟動(dòng)反式作用影響蛋白質(zhì)的修飾[9-10]。12號(hào)染色體通過轉(zhuǎn)錄就可生成的反式lncRNA，HOX基因轉(zhuǎn)錄本反義基因間RNA（HOXtranscript antisense intergenic RNA，HOTAIR），HOTAIR在上皮性癌細(xì)胞中的異位表達(dá)，在全基因組范圍內(nèi)招募PRC2形成早期的成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致組蛋白H3賴氨酸27甲基化、基因表達(dá)的改變[11]。EZH2是PRC2[11]的一個(gè)關(guān)鍵組成部分。EZH2與HOTAIR和Xist相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)[12-13]。相關(guān)研究表明[12]，HOTAIR與PRC2相互作用，選擇性地抑制基因表達(dá)。PRC2和賴氨酸特異性脫甲基酶1（LSD1）的引入抑制了染色體2上的40000BP H OX基因，并導(dǎo)致組蛋白抑制標(biāo)記H3K27me3的出現(xiàn)和組蛋白H3at賴氨酸4的三甲基化，3K4ME3丟失[14]。異位H19的表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的致瘤潛能[14]，卻對(duì)成纖維細(xì)胞有著抑制增殖的作用。本研究探討lncRNA-H19介導(dǎo)的組蛋白甲基化酶EZH2與燒傷后皮膚成纖維細(xì)胞增殖的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源：選取2013年6月-2016年5月于筆者醫(yī)院就診的8例燒傷瘢痕患者皮膚標(biāo)本，將這些組織切除，并于-80℃液氮中冷凍以供進(jìn)一步使用。所有患者均未使用過激素、中藥、放療或化療。瘢痕組織符合患者和觀察者瘢痕評(píng)定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，均由燙傷或燒傷形成，術(shù)前均經(jīng)患者知情同意，該試驗(yàn)方案均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。對(duì)照組取自8例正常成熟皮膚、8例成熟纖維組織。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用PBS沖洗燒傷組織及鄰近組織3次。用0.25%胰蛋白酶消化組織，移除上皮。組織勻漿后，用0.1%Ⅰ型Colla-genase（C-0130;Sigma-Aldrich;Merck KGaA，Darmstadt，德國）在37℃下振蕩3h消化組織。將樣品與等量的DMEM培養(yǎng)基（DMEM;SH 30023.01B;Hyclone;GE保健生命科學(xué)，Logan，UT，美國），10%胎牛血清（H30084.03;HyClone，GE保健生命科學(xué)）混合培養(yǎng)。在室溫下300g離心10min后，去掉清液，成纖維細(xì)胞被重新懸浮在高糖DMEM中。成纖維細(xì)胞接種于直徑100mm、密度為4×104/cm2的培養(yǎng)板上，在37℃、5% CO2和100%濕度下培養(yǎng)24h。24h后開始更換，隨后每3d更換一次。取經(jīng)過3次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與分組：脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA干擾以脂質(zhì)體為標(biāo)準(zhǔn)，制備轉(zhuǎn)染試劑與200LL小干擾RNA（siRNA）混合的復(fù)合物。N e 2 0 0 0 轉(zhuǎn)染試劑盒（ 1 1 6 6 8 0 1 9 ;Invitrogen ThermoFisher Science，Waltham）并添加到培養(yǎng)基中。以轉(zhuǎn)染的無干擾siRNA為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞置于37℃的5% CO2孵化器中孵育6h，在含10% FBS血清的1.5ml正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后將此部分細(xì)胞分配到空白組（未轉(zhuǎn)染）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA）、siRNA H19組、siRNA-EZH2組和siRNA H19+siRNA-EZH2組。并合成siRNA的引物序列。上?；蛑扑幱邢薰荆ㄖ袊虾＃iRNA-NC的上游序列為5-UUCUCCGAACGUGUCACGUU-3，下游序列為5-ACGGACACGUCGGAAU-3;siRNA HOTAIR為5-UUUCUCUAGGUGGUAC-3，下游序列為5-AUUUUUAAUAUGCUGCUG-3。SIEZH2的上游序列為5-TTCATGACAACACCACAT-3，以及下游序列為5-GAGAGCAGCGACAACTCCT-3。見表1。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）檢測(cè)：收集轉(zhuǎn)染1d后的成纖維細(xì)胞用Trizol Rea（A33254;Thermo Fisher Scientific，Waltham）提取上述細(xì)胞的總RNA。并用超微分光度計(jì)（NanoDrop2000;ThermoFisher）測(cè)定其濃度和純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。建立了逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）體系和PCR反應(yīng)程序PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性1min，95℃變性30s，72℃延伸60s，58℃退火5s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，以GAPDH的表達(dá)為參考，根據(jù)相對(duì)定量公式2-△△Ct，計(jì)算了H19的相對(duì)表達(dá)量，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖：在對(duì)數(shù)生長期收集成纖維細(xì)胞，在細(xì)胞生長培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)，接種96孔板，細(xì)胞密度為1×104/ml。每組細(xì)胞設(shè)置8個(gè)復(fù)孔進(jìn)行質(zhì)粒感染，在正常培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h。每孔去培養(yǎng)液用PBS洗滌三次后加入MTT（5mg/ml）20μl繼續(xù)培養(yǎng)，終止培養(yǎng)后，將孔內(nèi)上清液去掉，每孔加入150μlDMSO，震蕩使晶體充分溶解，酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長為490nm的吸光值。

1.2.5 Western blot檢測(cè)：采用上述方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和mTOR的表達(dá)。于轉(zhuǎn)染72h后收集細(xì)胞，按照說明書使用蛋白提取試劑盒提取蛋白。經(jīng)BrADFED定量分析后，進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)化、膜封閉、過夜抗體、VEGF、雷帕霉素靶蛋白（哺乳動(dòng)物靶向雷帕霉素、mTOR）和靶抗體法HRP標(biāo)記兩種抗體（康世紀(jì)）在室溫下孵育1h，洗膜后ECL呈彩色。圖像軟件灰色分析結(jié)果，GAPDH作為內(nèi)部參考，測(cè)定H19 siRNA、EZH2siRNA、H19siRNA+EZH2siRNA轉(zhuǎn)染組VEGF、mTOR的表達(dá)量。