林簡(jiǎn) 劉曉紅 王榮坤 李濤 李娜 陳惠娟

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩;永生化成纖維細(xì)胞系;微小RNA-501-5p;真核翻譯起始因子3L;靶向關(guān)系;調(diào)控

瘢痕疙瘩主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)皮膚創(chuàng)傷進(jìn)行修復(fù)時(shí)成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，其發(fā)生發(fā)展受多種基因的調(diào)控，并調(diào)控多種通路引起病變的進(jìn)展。目前研究認(rèn)為其調(diào)控的通路有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）通路、真核翻譯起始因子（eIF）通路及核因子通路等[1]。微小RNA（microRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的調(diào)控病變形成的因子，主要通過(guò)調(diào)控下游靶基因發(fā)揮生物學(xué)作用[2]。EIF可以受多種上游因子的調(diào)控。真核翻譯起始因子3L（eIF3L）是家族中的重要成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及膠原合成中有重要的作用[3]。本次在TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)microRNA -501-5p（miR-501-5p）與eIF3L可能具有結(jié)合位點(diǎn)（見(jiàn)表1、圖1）。基于此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用前瞻性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，檢測(cè)瘢痕疙瘩中miR-501-5p的表達(dá)，分析其與eIF3L的靶向關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料：選擇2018年5月-2019年12月確診為瘢痕疙瘩并行手術(shù)治療的患者41例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①腫塊隆起于皮膚表面，質(zhì)硬，表面光滑發(fā)亮，界限欠規(guī)則，1年內(nèi)無(wú)自然消退跡象;②病變超出原始損傷邊緣，向周?chē)＝M織發(fā)生浸潤(rùn)，蟹足狀生長(zhǎng);③具有持續(xù)性生長(zhǎng)、發(fā)紅、痛癢等癥狀，無(wú)自愈傾向，不能自行消退;④病理學(xué)證實(shí)瘢痕組織內(nèi)有膠原及基質(zhì)成分的大量沉積，成纖維細(xì)胞很多，并有分裂像。排除標(biāo)準(zhǔn)：①局部伴癌變者;②伴有嚴(yán)重皮膚疾病患者;③伴有風(fēng)濕免疫性疾病的患者。選擇同期在醫(yī)院確診為增生性瘢痕并行手術(shù)治療的患者41例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：損傷因素明確、瘢痕色澤紅、質(zhì)硬，高出皮膚，瘢痕的增殖不超過(guò)損傷范圍。選擇同期因體表皮下良性腫物切除術(shù)時(shí)切取的正常皮膚組織41例作為正常對(duì)照組。均留取術(shù)后的新鮮組織（-80℃凍存）及石蠟包埋組織。三組性別、年齡及BMI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05），見(jiàn)表2。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬簽定知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞系：永生化成纖維細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。取出后于37℃水中解凍，加入5ml培養(yǎng)液，混合，以1 000轉(zhuǎn)/min離心5min，倒出培養(yǎng)液加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，混合均勻并置于37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，待成纖維細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代，取3～4代用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：miR-501-5p的表達(dá)水平：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)3組中miR-501-5p的表達(dá)。取出凍存的標(biāo)本，稱取100mg進(jìn)行RNA的提取。引物合成由上海萊楓生物科技有限公司完成，miR-501-5p引物上游：5-AAATATGAAACTGATGGCAA-3，下游：5-TCATGAAACTGCGCACT-3。以U6為內(nèi)參，上游：5-GGAACGAGAAAGATTA-3下游：5-GGAATTCACGAAATTCCG-3。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15min;85℃5s;4℃。試劑購(gòu)自美國(guó)ABI和北京百泰克生物技術(shù)有限公司。反應(yīng)程序：95℃5min，1個(gè)循環(huán);95℃5s，64℃30s，72℃20s，共32個(gè)循環(huán)。60℃時(shí)采集信號(hào)，記錄Ct值，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因。ΔΔCt=[Ct目的基因（未知樣品）-Ct對(duì)照]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct對(duì)照]。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)eIF3L和Ki67蛋白：免疫組化SP法檢測(cè)瘢痕疙瘩中eIF3L和Ki67蛋白的表達(dá)。eIF3L、Ki67、二抗和DAB均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司。檢測(cè)基于石蠟包埋標(biāo)本。切取4μm切片，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（上皮細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照）。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，并由同一技師完成操作。eIF3L的陽(yáng)性部位是細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜，Ki67的陽(yáng)性部位是細(xì)胞核，選擇5個(gè)熱點(diǎn)區(qū)（400倍）進(jìn)行計(jì)數(shù)，由病理科醫(yī)師應(yīng)用盲法完成，計(jì)算陽(yáng)性率，取平均值。Ki67陽(yáng)性率亦稱為增殖指數(shù)。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建eIF3L的3UTR野生型基因序列及雙熒光報(bào)告基因表達(dá)的載體，構(gòu)建3UTR突變的雙熒光報(bào)告基因表達(dá)載體作為對(duì)照。共轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及miR-501-5p mimics，避光下檢測(cè)熒光素酶表達(dá)，觀察miR-501-5p與eIF3L的3UTR結(jié)合情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較應(yīng)用t 檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用方差分析（SNK法行兩兩比較），率的比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，均以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組miR-501-5p表達(dá)水平比較：觀察組、對(duì)照組和正常對(duì)照組miR-501-5p表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（經(jīng)SNK法行兩兩比較，P<0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

2.2 miR-501-5p在不同臨床病理特征分組中的表達(dá)比較：觀察組中miR-501-5p的表達(dá)在有無(wú)家族史及不同病程的分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。而在不同性別、年齡及Ki67增殖指數(shù)的分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。見(jiàn)表4。

2.3 瘢痕疙瘩組織中miR-501-5p與eIF3L的相關(guān)性：免疫組化檢測(cè)瘢痕疙瘩中eIF3L表達(dá)的陽(yáng)性率為5%～70%，平均24.5%，相關(guān)分析顯示瘢痕疙瘩中miR-501-5p和eIF3L具有正相關(guān)性（r =0.69，P=0.024）。見(jiàn)圖3～4。

2.4 eIF3L mRNA的3UTR是miR-501-5p的直接靶點(diǎn)：構(gòu)建含有野生型eIF3L mRNA 3-UTR序列的pGL3-basic質(zhì)粒（pGL3-eIF3L-WT）和miR-501-5p結(jié)合位點(diǎn)缺失的突變型eIF3L mRNA 3-UTR序列的質(zhì)粒（pGL3-eIF3L-MT），分別與空載體轉(zhuǎn)染組、miR-501-5p轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞后培養(yǎng)24h，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因試盒檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)。結(jié)果顯示miR-501-5p轉(zhuǎn)染組能引起轉(zhuǎn)染pGL3-eIF3L-WT的細(xì)胞系中熒光素酶活性降低，而對(duì)pGL3-eIF3L-MT組熒光素酶活性無(wú)明顯影響，提示eIF3L mRNA的3UTR是miR-501-5p的直接靶點(diǎn)。見(jiàn)圖5。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種皮膚的良性增生性疾病，具有惡性腫瘤向周?chē)＝M織浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，可以長(zhǎng)在體表的任何部位并且伴有難以忍受的瘙癢和刺痛感，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。此外，瘢痕疙瘩組織易發(fā)生感染、破潰，甚至癌變?yōu)轳：郯?。近年研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩病變組織中與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的基因可以出現(xiàn)異常失調(diào)[4-5]。MicroRNA表達(dá)失調(diào)可能是瘢痕疙瘩中重要的分子進(jìn)展因素。有研究顯示miR30a 5p通過(guò)靶基因BCL2調(diào)控瘢痕疙瘩的細(xì)胞凋亡和增殖，其可能是治療的重要靶點(diǎn)[6]。miR-501-5p是在基因庫(kù)中篩選出來(lái)的，主要是與瘢痕疙瘩病變的形成和進(jìn)展有關(guān)[7-8]。miR-501-5p對(duì)下游的增殖因子和凋亡因子有明確的調(diào)控作用，也是其發(fā)揮作用的重要方式[9-10]。

本研究結(jié)果顯示瘢痕疙瘩中miR-501-5p的表達(dá)明顯高于對(duì)照組和正常對(duì)照組，提示miR-501-5p高表達(dá)是引起瘢痕形成的重要促進(jìn)因子。結(jié)果顯示miR-501-5p的表達(dá)與家族史有關(guān)，其與遺傳因素及家族聚集性發(fā)病特征的具體機(jī)制有待更深入的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。結(jié)果顯示miR-501-5p與病程有關(guān)，提示miR-501-5p與瘢痕疙瘩的生長(zhǎng)密切相關(guān)。病程長(zhǎng)的患者病變體積大，病變細(xì)胞增殖活躍且具有較多的粗大膠原，因此miR-501-5p與病程的相關(guān)性可能與病變生長(zhǎng)過(guò)程中膠原的形成及病變?cè)鲩L(zhǎng)密切相關(guān)[11]。瘢痕疙瘩的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)與其具有腫瘤性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)有關(guān)，miR-501-5p高表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩生長(zhǎng)的作用可能與miR-501-5p對(duì)腫瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的作用相似[12]。研究發(fā)現(xiàn)miR-501-5p與eIF3L呈正相關(guān)性，提示二者具有協(xié)同正向作用，雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-501-5p與eIF3L的靶向作用，提示二者的通路作用存在，miR-501-5p為eIF3L的上游因子。EIF3L在病變形成中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用，其高表達(dá)可以引起病變的生長(zhǎng)[13]。由于eIF3L可能是調(diào)節(jié)翻譯的重要蛋白，因此瘢痕形成過(guò)程可能更多依賴于細(xì)胞翻譯后的調(diào)控作用。本研究是在基因?qū)W及組織學(xué)的角度的進(jìn)行的研究，由于eIF3L在作用過(guò)程中與基質(zhì)金屬蛋白酶等因子有關(guān)，因此eIF3L對(duì)細(xì)胞膠原化的形成及纖維細(xì)胞的增生可能具有明確的促進(jìn)作用。有研究顯示瘢痕疙瘩組織內(nèi)部呈現(xiàn)乏氧狀態(tài)，eIF3L與缺氧相關(guān)蛋白VEGF和HIF-1a均有關(guān)[14]，提示eIF3L在病變進(jìn)展中的作用可能涉及多種細(xì)胞因子間的聯(lián)合作用。作為上游因子的miR-501-5p對(duì)eIF3L具有的調(diào)控作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖、膠原化形成、缺氧后膠原的增生等生物學(xué)過(guò)程[15-16]，但是其具體通路后續(xù)研究中應(yīng)當(dāng)繼續(xù)關(guān)注。

總之，瘢痕疙瘩中miR-501-5p高表達(dá)，與家族史及病變?cè)錾潭认嚓P(guān)，miR-501-5p與eIF3L的表達(dá)具有靶向關(guān)系。