滕 渝, 楊紹明, 柏朝朋, 張 劍
(華東交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院, 南昌 330013)
分子印跡聚合物(MIPs)作為一種模擬型抗體, 不僅保留了抗體和抗原識(shí)別專一性的優(yōu)點(diǎn), 而且克服了抗體和抗原受環(huán)境影響大、 不穩(wěn)定及可重復(fù)利用性差等的缺點(diǎn)[1]. 將MIPs作為識(shí)別單元與具有靈敏度高、 分析速度快及儀器設(shè)備簡單等特點(diǎn)的電化學(xué)方法結(jié)合構(gòu)建的分子印跡電化學(xué)傳感器, 兼具M(jìn)IPs和電化學(xué)方法兩者的優(yōu)點(diǎn), 受到了廣泛關(guān)注. 目前, 分子印跡電化學(xué)傳感器已被用于檢測槲皮素[2]、 多巴胺[3]、 雙酚A[4]等小分子物質(zhì)以及牛血清白蛋白[5]、 血紅蛋白[6]等蛋白質(zhì)大分子物質(zhì).
對于檢測蛋白質(zhì)的分子印跡電化學(xué)傳感器, 因蛋白質(zhì)的尺寸較大、 功能基團(tuán)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜和多樣, 導(dǎo)致其傳質(zhì)受阻和洗脫困難等問題. 電聚合表面分子印跡方法因其分子印跡識(shí)別位點(diǎn)處于MIPs的表面薄層中, 可有效克服蛋白質(zhì)的傳質(zhì)受阻和洗脫困難等問題, 而成為用于檢測蛋白質(zhì)的分子印跡電化學(xué)傳感器中的常用方法[7]. 電聚合吡咯[8]、 鄰氨基酚[9]、 多巴胺[10]、 鄰苯二胺(o-PD)[11]和鉻黑T[12]等已被用于構(gòu)建檢測牛血清白蛋白、 肌紅蛋白、 前列腺特異抗原及人絨毛膜促性腺素等多種蛋白質(zhì)的分子印跡傳感器. 其中,o-PD具有較低的成膜電位, 易通過電聚合形成聚鄰苯二胺(POPD)分子印跡膜, 而且其具有氧化還原活性, 存在一對明顯的氧化還原峰, 可以作為蛋白質(zhì)檢測的分子印跡傳感器的電化學(xué)探針. 以分子印跡膜充當(dāng)電化學(xué)探針, 可以精簡探針的引入和簡化電極的制作過程. 此外, 利用電化學(xué)聚合形成的POPD分子印跡膜與目標(biāo)分子蛋白質(zhì)有特異性的相互作用, 可為蛋白質(zhì)的固定化提供一種有效的方法, 且此方法便捷、 穩(wěn)定不易脫落.
在蛋白質(zhì)檢測的分子印跡電化學(xué)傳感器中, 為了增強(qiáng)傳感器的檢測信號(hào), 提高傳感器的電子傳輸速率, 納米材料如碳材料[13,14]、 金屬納米材料[15,16]、 量子點(diǎn)[17,18]及復(fù)合材料[19]等被引入到傳感器的表面作為增敏材料. 碳材料中的碳納米管(CNTs)是其中的典型代表, 它是一種由碳原子形成的石墨稀片層卷成的無縫、 中空的一維新型碳結(jié)構(gòu), 具有優(yōu)良的力學(xué)、 電學(xué)和電化學(xué)性能[20~22], 且其比表面積大、 催化效率高[23,24].
辣根過氧化物酶(HRP)是一種糖蛋白, 由單個(gè)多肽鏈組成, 包括308個(gè)氨基酸殘基、 1個(gè)正鐵原卟啉(血紅素)和2個(gè)Ca2+, 相對分子質(zhì)量約為44000. 因其價(jià)格相對便宜、 催化活性和穩(wěn)定性高, HRP常用于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、 免疫傳感器、 酶傳感器和DNA傳感器等生物分析中催化放大檢測信號(hào), 以提升檢測的性能, 而且HRP的量與生物分析的性能密切相關(guān). 本文選用HRP為蛋白質(zhì)的典型代表, 將羧基化多壁碳納米管(MWCNTs)作為增敏材料, 以電聚合形成的POPD分子印跡膜為電化學(xué)探針, 構(gòu)建了靈敏度高、 選擇性和穩(wěn)定性好的HRP分子印跡傳感器. 此外, 以POPD分子印跡膜為固定化HRP的載體和電子介體, 構(gòu)建基于HRP催化活性的H2O2傳感器, 對該傳感器進(jìn)行表征的同時(shí)還對基于POPD分子印跡膜的傳感器檢測HRP和H2O2的性能進(jìn)行了研究.
辣根過氧化物酶(HRP, 250 U/mg, 上海三杰生物技術(shù)有限公司); 鄰苯二胺(分析純, 天津市大茂化學(xué)試劑廠); 碳納米管(CNTs, 純度≥97%, 深圳納米港有限公司); 30%過氧化氫(H2O2, 西隴科學(xué)股份有限公司); 葡萄糖氧化酶[100 U/mg, 生工生物技術(shù)(上海)有限公司]; 凝血酶(THR,Mw=36700 g/mol, 上海生物工程有限責(zé)任公司); 半胱氨酸(純度99%, 上海山浦化工有限公司); 酪氨酸(純度99%, 上海藍(lán)季發(fā)展有限公司); 磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH=6.8).
CHI660E型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司), 三電極體系: 鉑電極為對電極, Ag/AgCl 為參比電極, 玻碳電極為工作電極; Nova NanoSEM 450型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM, FEI捷克有限公司); X-Max20型能譜儀(英國牛津儀器公司).
稱取0.2 g MWCNTs, 加入40 mL H2SO4/HNO3(體積比為3∶1)混合酸溶液, 超聲8 h后抽濾, 濾液用去離子水洗滌至中性, 濾渣于80 ℃烘干[25]. 將裸玻碳電極置于1 mg/mL羧基化MWCNTs溶液中, 采用階躍電位法先于2.0 V恒電位下電沉積240 s, 再于-0.4 V恒電位下電沉積80 s, 制得 MWCNTs/GCE修飾電極[26]. 將該電極置于含0.1 mg/mL HRP, 0.3 mg/mLo-PD, 0.1 mol/L KCl和PBS緩沖液(pH=6.8)的電沉積液中, 采用循環(huán)伏安掃描法于0.8~-1.0 V電位范圍內(nèi)聚合30圈, 掃描速率為50 mV/s, 即在MWCNTs/GCE電極上制得印跡有HRP的POPD分子印跡聚合膜. 將該電極置于甲醇/乙酸(體積比2∶3)混合洗脫液中洗脫20 min, 除去聚合膜中的模板分子HRP. 另制備非分子印跡(NIP)傳感器, 其制備過程與MIPs傳感器相同, 只是在電聚合沉積液中不加模板分子.
Fig.1 SEM images of MWCNTs/GCE(A), POPD/GCE(B) and MIPs/MWCNTs/GCE before(C) and after(D) extracting HRP
Fig.2 EDS spectrum of MIPs/MWCNTs/GCE before extracting HRP
圖1(A)~(D)分別示出了MWCNTs/GCE電極, POPD/GCE電極及MIPs/MWCNTs/GCE電極洗脫HRP前、 后的表面形貌. 由圖1(A)可見, MWCNTs均勻地覆蓋在玻碳電極表面, 形成了一個(gè)多孔的框架結(jié)構(gòu), 且管徑分明、 形狀規(guī)則, 管徑分布在40~70 nm之間. 由圖1(B)可見, POPD在電極表面形成了一層致密的聚合膜. 由圖1(C)和(D)可見, MIPs均勻附著于MWCNTs表面, 與單純的MWCNTs相比, 附著有MIPs的MWCNTs管徑增大, 說明比表面積大的MWCNTs有利于MIPs的附著, 且形成的MIPs粒徑較小, 分散性好. 通過對比去除模板分子前后的聚合膜發(fā)現(xiàn), 洗脫模板分子HRP后電極表面形貌變得粗糙、 疏松, 呈現(xiàn)出多孔隙的形貌, 這是由于模板分子HRP離開聚合物膜后, 會(huì)在聚合膜上留下與模板分子結(jié)構(gòu)相匹配的印跡空穴, 印跡聚合膜根據(jù)印跡空穴的形狀及識(shí)別位點(diǎn)可特異性識(shí)別、 再吸附HRP.
對未洗脫模板分子的MIPs/MWCNTs/GCE修飾電極進(jìn)行了能譜分析, 如圖2所示, 可見C, O, N, Ca和Fe元素的峰, 結(jié)合圖1可知, 增敏材料MWCNTs已附載在玻碳電極表面. Ca和Fe元素峰為HRP的特征峰, N主要是鄰苯二胺的組成元素, 說明在電聚合鄰苯二胺的過程中, HRP與o-PD之間通過分子間作用力聚合在電極表面.
Fig.3 CV(A) and EIS(B) profiles of HRP molecularly imprinted sensor assembly process a. Bare GCE; b. MWCNTs/GCE; c. MIPs/MWCNTs/GCE before extracting HRP; d. MIPs/MWCNTs/GCE after rebinding HRP(1.0×10-7 mg/mL); e. MIPs/MWCNTs/GCE after extracting HRP.
為了驗(yàn)證MWCNTs的增敏效果及MIPs的特異性識(shí)別性能, 對相同條件下制備的MIPs/GCE, MIPs/MWCNTs/GCE和NIPs/MWCNTs/GCE 3種傳感器洗脫HRP前后的CV圖進(jìn)行了對比, 如圖4所示. 對比圖4譜線a,b和c,d可知, MIPs/GCE傳感器除去模板分子前后氧化還原峰電流和阻抗值變化幅度比MIPs/MWCNTs/GCE傳感器小, 說明MWCNTs可有效增大MIPs/MWCNTs/GCE傳感器的比表面積, 提高印跡膜中HRP的印跡位點(diǎn)數(shù)量, 從而促進(jìn)POPD膜與基底電極間的電子傳遞; MIPs/GCE的CV電位間距比MIPs/MWCNTs/GCE的大, 說明MWCNTs的引入更利于電子轉(zhuǎn)移; 且對比譜線b和d的峰電流(分別為63.25和50.19 μA)可知, 引入MWCNTs后會(huì)起到一定的信號(hào)增強(qiáng)作用. 由譜線e和f可知, NIPs/MWCNTs/GCE傳感器在模板分子洗脫前后氧化還原峰電流、 電位間距和阻抗值變化均較小, 這是由于NIPs/MWCNTs/GCE傳感器的印跡膜中不存在HRP分子, 洗脫前后不會(huì)出現(xiàn)印跡空穴所致.
Fig.4 CV(A—C) and EIS(D) profiles of different molecularly imprinted sensors a. MIPs/MWCNTs/GCE before extracting HRP; b. MIPs/MWCNTs/GCE after extracting HRP; c. MIPs/GCE before extracting HRP; d. MIPs/GCE after extracting HRP; e. NIPs/MWCNTs/GCE before extracting HRP; f. NIPs/MWCNTs/GCE after extracting HRP.
采用循環(huán)伏安法考察了MIPs/MWCNTs/GCE傳感器在0.01~1.0 V/s的掃描速率范圍內(nèi)對POPD峰電流的影響, 結(jié)果見圖5. 以氧化還原峰電流對掃描速率作圖, 通過線性擬合可知, 氧化還原峰電流(Ip/μA)與掃描速率呈正比, 線性方程為Ipa=-18.52-183.70ν(相關(guān)系數(shù)為0.986),Ipc=32.26+
187.80ν(相關(guān)系數(shù)為0.991), 可見POPD在電極上的氧化還原是一個(gè)受吸附控制的過程.
Fig.5 CV responses of MIPs/MWCNTs/GCE sensor with scan rates from 0.01 V/s to 1.0 V/s(A) and linear fitting curve between peak current to scan rate(B)
適量的功能單體更有利于印跡膜的形成, 但過多單體會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增加, 降低印跡膜對目標(biāo)分子的特異選擇性. 為確定功能單體和模板分子的最佳濃度比, 固定聚合液中HRP濃度為0.1 mg/mL, 改變o-PD的濃度, 使聚合單體和模板分子的濃度比分別為1∶1, 2∶1, 3∶1, 5∶1和10∶1, 采用差分脈沖法測量模板分子洗脫前后電極峰電流的變化ΔΙ(ΔΙ=Ι-Ι0,Ι0和I分別為洗脫模板分子前、 后的峰電流值)來確定最優(yōu)濃度比. 如圖S1(A)(見本文支持信息)所示, 當(dāng)o-PD與HRP的濃度比為3∶1時(shí), 峰電流差ΔΙ達(dá)到最大值, 說明由此濃度比制備的印跡膜中HRP的特異性結(jié)合位點(diǎn)最多, 印跡效果最好.
模板分子的去除效率對傳感器的檢測效果有著直接影響, 也是分子印跡傳感器制備過程的關(guān)鍵步驟之一. 如圖S1(B)(見本文支持信息)所示, MIPs/MWCNTs/GCE傳感器在甲醇/乙酸(體積比為2∶3)混合溶液中洗脫前后峰電流差ΔΙ最大, 這可能是由于在此酸性條件下, HRP與POPD之間的分子間作用力被削弱, 致使模板分子從聚合膜中被洗脫.
如圖S1(C)(見本文支持信息)所示, 峰電流差ΔΙ隨洗脫時(shí)間的增加而增大, 在15 min后趨于穩(wěn)定, 因此選擇15 min為MIPs/MWCNTs/GCE傳感器的最佳洗脫時(shí)間.
考察了不同pH值的測試底液對MIPs/MWCNTs/GCE傳感器性能的影響. 如圖S1(D)(見本文支持信息)所示, 當(dāng)pH在5.29~5.8范圍內(nèi)變化時(shí), 峰電流隨著pH的增大而增大, 并在pH=5.8時(shí)達(dá)到最大; 當(dāng)pH>5.8后, 峰電流隨pH的增大而減小. 在整個(gè)過程中, 峰電位逐漸負(fù)移, 說明聚合膜的活性位點(diǎn)在偏酸性條件下易被還原. 綜合以上結(jié)果可知, 測試底液的最佳pH=5.8.
模板分子在印跡膜上的吸附過程是影響分子印跡傳感器檢測效果的重要因素. 由于HRP分子進(jìn)入印跡空穴并達(dá)到吸附平衡需要一定時(shí)間, 因此選擇合適的孵育時(shí)間, 能顯著提高M(jìn)IPs/MWCNTs/GCE傳感器對HRP的電化學(xué)響應(yīng)及后續(xù)對H2O2的檢測效果. 如圖S1(E)(見本文支持信息)所示, 孵育前后峰電流差ΔΙ隨著孵育時(shí)間的增加, 呈先增大然后趨于穩(wěn)定的趨勢, 并于孵育20 min時(shí)達(dá)到穩(wěn)定, 這說明HRP分子在印跡聚合膜上已達(dá)到吸附平衡, 印跡膜上有效印跡空穴已基本被HRP分子占據(jù), 因而最佳孵育時(shí)間為20 min.
在最優(yōu)檢測條件下, 利用差分脈沖伏安(DPV)法考察了MIPs/MWCNTs/GCE傳感器在不同濃度HRP溶液中孵育后的電化學(xué)性能, 結(jié)果如圖6(A)所示. 可見, MIPs/MWCNTs/GCE電極的響應(yīng)電流隨著HRP濃度的增大而逐漸降低, 這是由于隨著HRP濃度的增大, 印跡膜中的特異性識(shí)別空穴逐漸被HRP分子占據(jù), 阻礙了POPD與基底電極之間的電子傳遞. 圖6(B)為孵育前后傳感器對HRP的響應(yīng)電流差ΔΙ與HRP濃度的對數(shù)lgc之間的線性關(guān)系圖, 可見, MIPs/MWCNTs/GCE傳感器的響應(yīng)電流與HRP濃度在1.0×10-10~1.0×10-5mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系, 線性回歸方程為ΔΙ=-90.40-5.32lgc, 相關(guān)系數(shù)為0.991, 檢出限為1.5×10-11mg/mL(S/N=3).
實(shí)驗(yàn)采用計(jì)時(shí)電流法實(shí)現(xiàn)了對H2O2的分析檢測. 將制備的分子印跡電極置于1.0×10-8mg/mL HRP溶液中孵育20 min后, 在-0.37 V電位下, 于攪拌下每隔30 s向10.0 mL 0.2 mol/L的PBS緩沖溶液(pH=5.8)中連續(xù)滴加40 μL 100 μmol/L的H2O2溶液, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6(C)所示. 可見, MIPs/MWCNTs/GCE電極的響應(yīng)電流隨著H2O2濃度的增大而增大, 表明MIPs/MWCNTs/GCE電極對H2O2有良好的電催化作用. 圖6(D)為由圖6(C)給出的響應(yīng)電流對H2O2濃度的線性關(guān)系圖, 可見, MIPs/MWCNTs/GCE電極的響應(yīng)電流與H2O2濃度在0.4~14 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系, 線性方程為ΔΙ=-0.88+12.28cH2O2, 相關(guān)系數(shù)為0.992, 檢出限為2.6×10-7mol/L(S/N=3).
Fig.6 DPV response of MIPs/MWCNTs/GCE sensor to different concentrations of HRP(A) and corresponding linear fitting curve(B), I-t curve of the MIPs/MWCNTs/GCE modified electrode to successive addition of H2O2(C) and corresponding linear fitting curve(D) a. Blank; concentration of curve a—k: 10-10—10-5 mg/mL.
為了進(jìn)一步證明該傳感器檢測H2O2的性能, 將其分析性能與其它傳感器的性能進(jìn)行了比較. 由表1數(shù)據(jù)可見, 本文開發(fā)的傳感器表現(xiàn)出理想的分析性能, 在檢出限和靈敏度方面略優(yōu)于其它傳感器.
Table 1 Analytical performances of H2O2 sensors based on HRP
為了進(jìn)一步驗(yàn)證模板分子在印跡膜上的吸附動(dòng)力學(xué)是分子印跡傳感器的一項(xiàng)重要性能指標(biāo), 利用DPV法測得MIPs/MWCNTs/GCE和NIPs/MWCNTs/GCE修飾電極在1.0×10-8mg/mL HRP溶液中的吸附圖. 如圖7所示, 并根據(jù)Langmuir吸附模型, 擬合2種修飾電極吸附HRP的動(dòng)力學(xué)曲線得到動(dòng)力學(xué)模型, 動(dòng)力學(xué)方程為
ΔIp=ΔIpmt/(k+t)
式中:t(min)為吸附時(shí)間;k(min)為動(dòng)力學(xué)結(jié)合常數(shù); ΔIp(μA)為傳感器吸附目標(biāo)分子t時(shí)間后的響應(yīng)電流與空白時(shí)的差值; ΔIpm(μA)為平衡時(shí)刻響應(yīng)電流變化值.
Fig.7 Kinetic response curves of HRP at different sensors
由圖7可以看出, MIPs/MWCNTs/GCE傳感器結(jié)合HRP分子的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NIPs/MWCNTs/GCE傳感器, 這是由于NIPs/MWCNTs/GCE傳感器中沒有HRP分子的結(jié)合位點(diǎn)所致.
擬合后所得擬合參數(shù)如表2所示, 推測得MIPs/MWCNTs/GCE傳感器的吸附動(dòng)力學(xué)方程為ΔIp(MIPs)=-4.05×10-5t/(1.52+t), NIPs/MWCNTs/GCE傳感器的吸附動(dòng)力學(xué)方程為ΔIp(NIPs)=-4.75×10-6t/(0.06+t). 印跡因子α可以反映MIPs/MWCNTs/GCE與NIPs/MWCNTs/GCE對目標(biāo)分子特異性識(shí)別能力的差別,α數(shù)值越大, 則該傳感器對目標(biāo)分子的特異性識(shí)別能力越強(qiáng). 根據(jù)擬合參數(shù)ΔIpm和計(jì)算公式αMIPs=ΔIpm(MIPs)/ΔIpm(NIPs), 計(jì)算得出傳感器的印跡因子αMIPs=8.53, 說明MIPs/MWCNTs/GCE傳感器對HRP分子有較強(qiáng)的特異性識(shí)別能力.
Table 2 Adsorption kinetic curve parameters of different sensors
Fig.8 Responses of MIPs/MWCNTs/GCE to different substances
用1.0×10-8mg/mL HRP與濃度為其10倍的凝血酶(THR)、 葡萄糖氧化酶(GOx)、 半胱氨酸(Cys)和酪氨酸(Tyr)進(jìn)行了選擇性測試. 如圖8所示, MIPs/MWCNTs/GCE傳感器識(shí)別HRP前后的DPV峰電流變化值ΔΙ遠(yuǎn)高于NIP電極, 而其它4種干擾物質(zhì)在印跡電極上的ΔΙ值遠(yuǎn)低于HRP, 表明制備的分子印跡電極對HRP有較強(qiáng)的特異性吸附能力, 具有良好的選擇性.
實(shí)驗(yàn)中采用相同方法制備了6個(gè)MIPs/MWCNTs/GCE電極, 分別測定其在1.0×10-8mg/mL HRP溶液中孵育20 min后, 再置于PBS緩沖溶液(含0.1 mol/L NaCl, pH=5.8)中的DPV響應(yīng), 所得結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.36%; 使用同1個(gè)MIPs/MWCNTs/GCE電極, 在1.0×10-8mg/mL HRP溶液中孵育20 min后, 再置于PBS緩沖溶液(含0.1 mol/L NaCl, pH=5.8)中進(jìn)行連續(xù)5次測定, 所得結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.62%, 表明制備的分子印跡電極具有良好的重現(xiàn)性.
將制備的MIPs/MWCNTs/GCE電極置于1.0×10-8mg/mL HRP溶液中孵育20 min后, 于4 ℃下保存, 7 d其響應(yīng)電流僅降低2.1%, 表明制備的MIPs/MWCNTs/GCE電極具有良好的穩(wěn)定性.
為考察該傳感器檢測H2O2的重復(fù)性, 采用6支MIPs/MWCNTs/GCE電極, 在1.0×10-8mg/mL HRP溶液中孵育20 min后, 對濃度為9.8 μmol/L的H2O2進(jìn)行測試, 所得6次電流值的RSD為4.21%; 用1個(gè)電極對濃度為9.8 μmol/L的H2O2重復(fù)測試5次所得電流值的RSD為4.57%, 表明該傳感器用于檢測H2O2有較好的重復(fù)使用性.
取江西鑫隆醫(yī)藥公司生產(chǎn)的H2O2消毒液稀釋1×106倍進(jìn)行實(shí)際樣品測試, 所得結(jié)果如表3所示, 回收率在91.2%~97.1%之間, 表明該傳感器可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測.
Table 3 Recovery results of hydrogen peroxide
以HRP為模板分子, MWCNTs作為增敏材料, 制備了可同時(shí)檢測HRP和H2O2的分子印跡電化學(xué)傳感器. 對單體與模板的比例、 洗脫時(shí)間、 洗脫液組成、 測試底液pH值及孵育時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化, 并對傳感器進(jìn)行了表征和監(jiān)測. 該分子印跡電化學(xué)傳感器對HRP和H2O2的檢測具有較寬的線性范圍和較低的檢出限, 可作為檢測酶及其酶促底物的雙分析物傳感器.
支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190485.