張培華，陳金佩，王曉曉，董洋利，姚藝新*，葉 玲

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 普寧 515300；3.德陽(yáng)市食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 德陽(yáng) 618000；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350122)

玉屏風(fēng)顆粒來(lái)源于玉屏風(fēng)散，出自元·危亦林《世醫(yī)得效方》，由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)組成，具有益氣、固表、止汗之功，為治療表虛自汗證的代表方，亦治虛人腠理不固，易感風(fēng)邪[1]。玉屏風(fēng)顆粒為國(guó)家中藥保護(hù)品種，收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部?，F(xiàn)代研究表明玉屏風(fēng)顆粒能夠提高機(jī)體免疫力，療效確切，臨床應(yīng)用廣泛。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究表明，無(wú)機(jī)元素具有極強(qiáng)形成配合物的能力，易與生物體內(nèi)含氮、氧、硫的配體形成配位鍵，協(xié)調(diào)體內(nèi)物質(zhì)平衡[2-4]。中藥無(wú)機(jī)元素的含量、種類能夠影響中藥的性味功效。如Zn、Ca、Fe元素是止血類中藥的特征無(wú)機(jī)元素；K元素和Mg元素能夠影響活血化瘀藥的藥性；Fe、Mn含量的差異是“寒涼溫?zé)帷彼幮缘幕A(chǔ)等[5-7]。說(shuō)明無(wú)機(jī)元素的種類和含量對(duì)藥效的發(fā)揮具有一定的協(xié)同作用。在中藥復(fù)方中，明確無(wú)機(jī)元素的種類和特征，可以從無(wú)機(jī)元素的角度對(duì)復(fù)方的療效研究提供參考[8]。

目前尚未有對(duì)玉屏風(fēng)顆粒無(wú)機(jī)元素的研究。為此，本研究建立測(cè)定玉屏風(fēng)顆粒18種無(wú)機(jī)元素含量的ICP-MS法，建立玉屏風(fēng)顆粒的無(wú)機(jī)元素特征圖譜，運(yùn)用主成分分析玉屏風(fēng)顆粒中與功效相關(guān)的無(wú)機(jī)元素，以期為玉屏風(fēng)顆粒的臨床療效提供基礎(chǔ)研究。

1 儀器與試劑

CEM MARS6型微波消解儀(德國(guó)Berghof公司)；7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS，美國(guó)安捷倫公司)；BAS2245型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；DHG-9013A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒儀器有限公司)；Milli-Q型超純水機(jī)(Millipore Bedford MA，美國(guó))；Agilent 1260型超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

SPEXertificate 9種標(biāo)準(zhǔn)溶液包含Mo、Pd、Re、S、Sb、Si、Sn、Ti、W(批號(hào)1-194AB，美國(guó)SPEX公司)；SPEXertificate 24種標(biāo)準(zhǔn)溶液包含B、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba、W(批號(hào)2-192AB，美國(guó)SPEX公司)；質(zhì)量濃度1 000 μg/mL；內(nèi)標(biāo)溶液：73Ge(批號(hào)GSB 04-1728-2004)、115In(批號(hào) GSB04-1731-2004)、209Bi(批號(hào) GSB 04-1719-2004)的單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)，購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；濃硝酸為MOS級(jí)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲醇為色譜純(CRVDE公司)；甲醇、三氯甲烷均為分析純(西隴科學(xué)股份有限公司)；超純水由ULUP-IV-10T型優(yōu)普超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)制備。15份玉屏風(fēng)散均由藥店購(gòu)買(mǎi)，樣品信息，詳見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 樣品預(yù)處理

取樣品粉末 0.2 g(5號(hào)篩)，精密稱定，于聚四氟乙烯消解罐中，置于通風(fēng)櫥，加入濃硝酸 8 mL，放置過(guò)夜。第2天放入微波消解儀中，按設(shè)定的消解程序處理：先經(jīng)10 min由室溫升至130 ℃，并維持5 min消解，然后10 min由130 ℃升至165 ℃，并維持10 min消解，然后15 min由165 ℃升至180 ℃，并維持40 min消解。消解完畢后，冷卻至室溫，取出消解罐，在通風(fēng)櫥中將酸揮盡，轉(zhuǎn)移用去離子水定容至50 mL。同步以濃硝酸8 mL做空白試驗(yàn)。

表1玉屏風(fēng)顆粒樣品信息

2.2 測(cè)定條件的優(yōu)化

儀器自動(dòng)調(diào)諧設(shè)定工作參數(shù)，以靈敏度、背景、穩(wěn)定性等各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)儀器的工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。測(cè)定條件：等離子射頻功率1 550 W，等離子氣體15 L/min，輔助氣體流量1 L/min，霧化氣流量1 L/min，補(bǔ)償/稀釋氣體1 L/min，霧化室溫度2 ℃，蠕動(dòng)泵速度0.3 rps。積分時(shí)間1 s，延遲時(shí)間1 s，重復(fù)次數(shù)3次；測(cè)量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰強(qiáng)。以73Ge、115In、209Bi 為內(nèi)標(biāo)，監(jiān)測(cè)信號(hào)的變動(dòng)情況，能有效克服儀器信號(hào)的漂移和校正基體效應(yīng)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取元素 B、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，用10%HNO3作空白溶液，把母液稀釋成5、10、20、50、100 μg/mL。

根據(jù)試樣中待測(cè)元素的水平配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次測(cè)定15種無(wú)機(jī)元素的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入73Ge、115In、209Bi內(nèi)標(biāo)溶液，同時(shí)配制標(biāo)準(zhǔn)空白溶液。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以待測(cè)元素分析峰信號(hào)值與內(nèi)標(biāo)元素參比峰響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各元素標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。結(jié)果各元素在0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。詳見(jiàn)表2。

表218種無(wú)機(jī)元素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和線性范圍

續(xù)表218種無(wú)機(jī)元素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和線性范圍

2.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取混標(biāo)分別連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定研究中涉及到的元素含量，18種無(wú)機(jī)元素的RSD值為0.76%～2.09%，表明儀器的精密性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取同一份玉屏風(fēng)顆粒樣品的待測(cè)溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 測(cè)定24種元素的含量。RSD值為0.78%～2.11%，表明待測(cè)溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果詳見(jiàn)表3。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別精密稱取同一份川玉屏風(fēng)顆粒樣品各6份，制成供試品溶液，測(cè)定24種元素的含量。除Re外，其余元素的RSD值為1.38%～4.01%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。結(jié)果詳見(jiàn)表3。

加樣回收率試驗(yàn)：分別精密稱取已測(cè)定的玉屏風(fēng)顆粒樣品0.2 g，6份，精準(zhǔn)加入一定量的各元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其含量，計(jì)算18種元素的回收率，回收率為92.80～106.40%，RSD值為1.98%～4.29%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確性高。結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.5 樣品的測(cè)定

按照“2.1”項(xiàng)制備玉屏風(fēng)顆粒的供試品溶液。在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定供試品溶液中這18種無(wú)機(jī)元素的含量。15份樣品中18種無(wú)機(jī)元素的含量詳見(jiàn)表4。

表4玉屏風(fēng)顆粒的含量 (mg/kg)

續(xù)表4玉屏風(fēng)顆粒的含量 (mg/kg)

續(xù)表4玉屏風(fēng)顆粒的含量 (mg/kg)

3 結(jié)果與討論

3.1 玉屏風(fēng)顆粒無(wú)機(jī)元素特征圖譜的建立

由于玉屏風(fēng)顆粒中無(wú)機(jī)元素的含量差異極大，為便于繪制無(wú)機(jī)元素的特征圖譜，將K縮小100倍，F(xiàn)e縮小10倍，至同一數(shù)量級(jí)得到各元素的相對(duì)含量，以元素種類為橫坐標(biāo)，相對(duì)含量為縱坐標(biāo)繪制特征圖譜。得到15份玉屏風(fēng)顆粒樣品18種無(wú)機(jī)元素的特征圖譜和玉屏風(fēng)顆粒18種無(wú)機(jī)元素的平均特征圖譜。詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖115份玉屏風(fēng)顆粒18種無(wú)機(jī)元素的特征

圖2 玉屏風(fēng)顆粒18種無(wú)機(jī)元素的平均特征

3.2 玉屏風(fēng)顆粒的主成分分析

主成分分析可以通過(guò)降維方式，綜合多指標(biāo)形成一個(gè)新的指標(biāo)，同時(shí)研究多指標(biāo)與綜合指標(biāo)的相關(guān)性。為此，運(yùn)用主成分分析研究玉屏風(fēng)顆粒中18種無(wú)機(jī)元素，前2個(gè)主成分初始特征值累積的百分比91.496%(大于85%)，初始特征值分別為12.737、3.733，根據(jù)得到總方差的解釋和成分矩陣，計(jì)算2個(gè)主成分的表達(dá)式，分別用Z1、Z2表示如下：

Z1=0.991*K+0.983*Ca+0.955*Ti+0.970*V+0.963*Cr+0.946*Mn+0.972*Fe+0.938*Co+0.961*Ni+0.985*Cu+0.966*Zn+0.942*Se+0.974*Sr+0.117*Mo+0.308*Cd+0.471*Sn+0.329*Sb+0.427*Ba

Z2=-0.040*K+0.059*Ca - 0.210*Ti - 0.178*V - 0.222*Cr+0.211*Mn - 0.216*Fe - 0.266*Co - 0.230*Ni - 0.083*Cu - 0.106*Zn - 0.214*Se+0.069*Sr+0.701*Mo+0.903*Cd+0.810*Sn+0.795*Sb+0.851*Ba

把2個(gè)主成分相加，得到總的表達(dá)式：Z總=(12.737*Z1+3.733*Z2)/ 2 =6.240*K+6.372*Ca+5.692*Ti+5.847*V+5.719*Cr+6.419*Mn+5.788*Fe+5.480*Co+5.693*Ni+6.122*Cu+5.955*Zn+5.599*Se+6.330*Sr+2.052*Mo+3.646*Cd+4.511*Sn+3.581*Sb+4.307*Ba

在Z總表達(dá)式中，以每種元素的系數(shù)來(lái)代表每種元素與主成分分析綜合得分的相關(guān)性，18種無(wú)機(jī)元素與綜合得分均呈正相關(guān)，相關(guān)性從大到小依次為，Mn、Ca、Sr、K、Cu、Zn、V、Fe、Cr、Ni、Ti、Se、Co、Sn、Ba、Cd、Sb、Mo，見(jiàn)表5。

表515份玉屏風(fēng)顆粒樣品主成分分析的綜合得分值排序

以主成分分析的綜合得分值代表無(wú)機(jī)元素的豐富度，云南白藥集團(tuán)有限公司的玉屏風(fēng)顆粒(99 911.9，n=6)>國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司的玉屏風(fēng)顆粒(59 487.4，n=9)。

3.3 玉屏風(fēng)顆粒的功效無(wú)機(jī)元素分析

表6 玉屏風(fēng)顆粒18種元素的成分矩陣、含量平均值、相關(guān)系數(shù)和貢獻(xiàn)率

在18種無(wú)機(jī)元素的貢獻(xiàn)率中，貢獻(xiàn)率最大的為K元素，貢獻(xiàn)率為97.745%，其次為Fe、Ca，貢獻(xiàn)率分別為0.913%、0.755%。玉屏風(fēng)顆粒主治表虛不固、自汗惡風(fēng)或體虛易感風(fēng)邪者。表虛不固，在中醫(yī)診斷中的癥狀常伴有有“疲倦、少氣懶言”等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明玉屏風(fēng)散具有雙向調(diào)節(jié)免疫功能、抗菌、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)、抗衰老、增加腎上腺皮質(zhì)功能、調(diào)節(jié)體溫等作用[9]。K在機(jī)體分布廣泛，是人體所需礦物質(zhì)中較大量的元素之一。與骨骼肌、神經(jīng)傳導(dǎo)和心肌活動(dòng)關(guān)系息息相關(guān)。它大部分存在于細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞外液的Na共同維持體內(nèi)酸堿平衡、正常的滲透壓及水分，調(diào)節(jié)機(jī)體平衡。人體鉀缺乏會(huì)降低肌肉的興奮性，使肌肉的收縮和舒張異常，容易出現(xiàn)倦怠狀態(tài)[10-11]。玉屏風(fēng)顆粒中的無(wú)機(jī)元素以K為主，說(shuō)明很有可能是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝而起到治療“表虛不固”的作用。需要結(jié)合臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。