葉 慧，喬 正，姜 瑋，李 敏*

(1.泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 泰州 225300；2.泰州市醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，江蘇 泰州 225300)

脈管復(fù)康膠囊屬于國(guó)家基本藥物品種，現(xiàn)行執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)收錄在《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》2014年中藥(二)(標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行編號(hào)為YBZ25562005-2011Z)[1]，主要由丹參、雞血藤兩味藥材經(jīng)過(guò)煎煮、濃縮，再加入郁金、乳香、沒(méi)藥粗粉混勻、干燥制成，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床上主要用于瘀血阻滯、脈管不通引起的脈管炎、硬皮病、動(dòng)脈硬化性下肢血管閉塞癥，對(duì)冠心病、腦血栓后遺癥也有一定治療作用[2-5]。

脈管復(fù)康膠囊處方中丹參藥材為君藥，目前已報(bào)道的丹參的化學(xué)活性成分達(dá)100余種[6-10]，以對(duì)丹參中水溶性成分和脂溶性成分進(jìn)行測(cè)定的方法來(lái)評(píng)價(jià)丹參及其制劑質(zhì)量多有報(bào)道[11-15]。藥品處方中丹參主要通過(guò)煎煮、濃縮入藥，保留水溶性成分，脂溶性成分流失；水溶性成分主要以酚酸類成分為主，如丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B等。脈管復(fù)康膠囊現(xiàn)行執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中，采用不同的色譜條件，在280 nm波長(zhǎng)測(cè)定丹參素鈉的含量、在278 nm波長(zhǎng)測(cè)定丹酚酸B的含量，工作量大且繁雜，不能全面體現(xiàn)脈管復(fù)康膠囊的質(zhì)量。本研究目的在于建立HPLC法同時(shí)測(cè)定脈管復(fù)康膠囊中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的含量，既豐富了脈管復(fù)康膠囊的定量指標(biāo)，又為更加全面地評(píng)價(jià)和控制其質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity Arc高效液相色譜儀(包括Empower?3工作站，四元梯度泵，2998 PDA檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱，美國(guó)Waters公司)；8200型超聲波清洗器(功率500 W，頻率53 kHz，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；LR16-A型高速離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)；XS105DU型電子天平(十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler公司)；AL204型電子天平(萬(wàn)分之一，瑞士Mettler公司)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)M ILLIPORE公司)。

1.2 試藥

丹參素鈉對(duì)照品(批號(hào)：110855-201614，純度：98.1%)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)：111562-201716，純度：94.1%)、原兒茶醛對(duì)照品(批號(hào)：110810-201608，純度：99.3%)、迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào)：111871-201706，純度：90.5%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹酚酸A(批號(hào)：P12O8F45509，HPLC≥98%)、紫草酸(批號(hào)：Y04J10H75487，HPLC≥98%)均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；脈管復(fù)康膠囊(陜西東泰制藥有限公司，批號(hào)：8E07、8D01、8F14)；色譜純乙腈(西班牙薩勞公司)；甲醇為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge? C18(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：0.05%三氟乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～30 min，2%B～33%(B)；30～35 min，33%～2%(B)；35～45 min，2%(B)；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)均不低于5 000，相鄰峰之間分離度均大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A對(duì)照品適量，精密稱定，加10%甲醇溶液制成濃度分別為78.09、3.94、5.27、8.13、87.32和16.27 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。

2.2.2 供試品溶液的配制 取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，12 000 r/min離心10 min，作為供試品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液2、5、8、10、15、20、25 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄上述6種成分的峰面積，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的峰面積的RSD分別為0.80%、0.27%、0.40%、0.55%、0.38%和0.53%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份(批號(hào)：8E07)，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A的平均含量(n=6)分別為4.62 、0.206、0.430 、0.790、3.14和2.00 mg/粒，RSD分別為0.63%、0.92%、1.41%、2.20%、0.60%、1.00%，表明本方法重復(fù)性好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一份供試品溶液(批號(hào)：8E07)，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果A峰面積的RSD(n=6)分別為0.17%、1.02%、1.18%、1.79%、0.19%和0.57%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 方法專屬性考察 取缺丹參藥材的陰性樣品，依法制備陰性樣品溶液；按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，對(duì)照品溶液出峰順序?yàn)椋旱⑺剽c、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A，結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液相應(yīng)峰保留時(shí)間一致，陰性樣品溶液無(wú)干擾，且各組相鄰成分之間分離度較好，R>1.5。詳見(jiàn)圖1。

A.混合對(duì)照品；B.樣品；C.陰性樣品；1.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.迷迭香酸；4.紫草酸；5.丹酚酸B；6.丹酚酸A

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)：8E07)6份，每份0.25 g，精密稱定于100 mL容量瓶中，每份精密加入丹參素鈉(135.77 μg/mL)、原兒茶醛(25.20 μg/mL)、迷迭香酸(121.67 μg/mL)、紫草酸(39.83 μg/mL)、丹酚酸B(107.93 μg/mL)、丹酚酸A(39.87 μg/mL)的混合對(duì)照品溶液10 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.4 樣品測(cè)定

取3個(gè)批次脈管復(fù)康膠囊(批號(hào)：8E07、8D01、8F14)，每批取0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A的含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/粒，n=3)

3 討論

3.1 有效成分的選擇

丹參中水溶性的酚酸類成分遇熱易分解，脈管復(fù)康膠囊的制法中采用煎煮水提的方法提取有效成分，進(jìn)而導(dǎo)致一些遇熱易分解的成分損失，由于6個(gè)成分均是受熱易分解的成分，故在樣品溶液前處理過(guò)程中盡量避免加熱等，所以色譜柱溫選擇25 ℃，且進(jìn)樣時(shí)樣品溫度選擇10 ℃，樣品溶液在儲(chǔ)存過(guò)程中選擇4 ℃避光保存[18-21]。

3.2 前處理及流動(dòng)相的考察

在選擇流動(dòng)相組成及比例時(shí)，考察了甲醇-水體系與乙腈-水體系對(duì)基線、峰型以及分離度等的影響。通過(guò)比較研究，乙腈-水體系梯度洗脫時(shí)的峰型以及分離度均優(yōu)于甲醇-水體系，其能夠較好地分離丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A 6種成分，同時(shí)加入0.05%的三氟乙酸以獲得更優(yōu)的峰型。

本文所測(cè)得6個(gè)成分均為水溶性酚酸類成分，在溶劑選擇時(shí)分別選用水、10%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇，結(jié)果10%甲醇為提取溶劑時(shí)，丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸提取效率最高，而甲醇作為提取溶劑時(shí)，丹酚酸B和丹酚酸A，提取效率最高，綜合考慮，最終選用10%甲醇作為提取溶劑；在物料比例選擇中，分別稱取0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 g，經(jīng)相同的前處理過(guò)程，總體看來(lái)6個(gè)成分在稱樣量為0.5 g時(shí)，提取效率最佳；在提取方式的考察時(shí)，回流提取和超聲過(guò)程均會(huì)導(dǎo)致有效成分的分解變質(zhì)，而且在成藥的制法中，水溶性有效成分已經(jīng)通過(guò)水提的方式提取出，故選用直接溶解的方式。

本文在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，新增原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸A 4個(gè)化學(xué)成分的含量測(cè)定，以丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A作為考察指標(biāo)，補(bǔ)充了原標(biāo)準(zhǔn)的不足之處，節(jié)約成本的同時(shí)又大大提高了工作效率。該方法快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性高，可作為脈管復(fù)康膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。