吳 進(jìn)，劉 廣，傘 勤，鄭敏麟*，江 澍*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122)

心血管疾病(cadiovascular disease，CVD)在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)人群中是非常普遍的，研究表明33%的CKD患者同時(shí)患有CVD[1]。且當(dāng)CKD患者出現(xiàn)心血管病變時(shí)，死亡的風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)變得更大[2]。而引起CKD患者發(fā)生CVD的因素有很多，除了傳統(tǒng)的心血管系統(tǒng)的危險(xiǎn)因素[3]，如高血壓、高血脂、高膽固醇外，越來(lái)越多的證據(jù)表明尿毒癥毒素[4]可能是CKD中CVD發(fā)生的罪魁禍?zhǔn)住６蛩徇胚岱?Indolophenol sulfate，IS)是一種與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子化和類尿毒素[5]，可以通過(guò)誘導(dǎo)全身氧化應(yīng)激狀態(tài)，造成心血管損害[6]，進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，抑制IS所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷可能能夠減輕心肌細(xì)胞損傷，從而達(dá)到減緩CKD中CVD的發(fā)生。

黃芪，又名棉芪，是一種多年生草本植物，藥用歷史已有兩千多年，最早被《神農(nóng)本草經(jīng)》記錄在冊(cè)，常被用在補(bǔ)氣升陽(yáng)、利尿脫毒等用途。黃芪的主要活性成分有黃芪多糖、黃芪皂甙、葉酸、黃芪黃酮及多種氨基酸等，其中，黃芪多糖得到了廣泛關(guān)注[7]。黃芪多糖屬于生物大分子成分，具有多種功能，而根據(jù)孫成文等[8]的研究，黃芪多糖可以改善心肌收縮性能并有效緩解心肌因氧化損傷而導(dǎo)致的損害。筆者根據(jù)以上特性，在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)在細(xì)胞層面利用黃芪多糖干預(yù)被硫酸吲哚酚損傷的大鼠心肌細(xì)胞，來(lái)探討黃芪多糖對(duì)硫酸吲哚酚誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 藥品和試劑

硫酸吲哚(sigma公司)；黃芪多糖(北京索萊寶科技有限公司)；F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(HYCLONE公司)；MTT、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、上樣緩沖液、TBS(武漢博士德生物工程有限公司)；Caspase-3、Caspase-9引物(Servicebio公司)。

1.2 細(xì)胞株

H9c2細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.3 主要儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；電子天平(美國(guó)奧豪斯公司)；-80 ℃超低溫冰箱(德國(guó)艾本德股份公司)；小型垂直電泳槽，超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1心肌細(xì)胞培養(yǎng)

將H9c2細(xì)胞株置于DEMM/F12完全培養(yǎng)基中，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到85%～95%時(shí)，用胰蛋白酶消化，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2CCk8法檢測(cè)不同劑量黃芪多糖對(duì)硫酸吲哚酚導(dǎo)致?lián)p傷的心肌細(xì)胞的作用

將細(xì)胞消化下來(lái)后，利用完全培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，在96孔板中每個(gè)孔加入100 μL的細(xì)胞混懸液，將96孔板放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后向培養(yǎng)板加入不同濃度的黃芪多糖，24 h后再加入硫酸吲哚酚。再將培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱孵育24 h。24 h后向每孔加入10 μL CCK8溶液，再在培養(yǎng)箱孵育3 h。酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。細(xì)胞活力(%)=(加藥組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)

2.3 利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平

按1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使最終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平。

2.4RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase-3，Caspase-9mRNA表達(dá)水平

將細(xì)胞接種至6孔板中，經(jīng)過(guò)藥物處理后，吸去原來(lái)的培養(yǎng)基，然后在各孔加入1 mL的Trizol，提取RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板建立RT-qPCR反應(yīng)體系，PCR引物序列見(jiàn)表1，設(shè)定反應(yīng)程序如表2所示。

表1Caspase-3、Caspase-9引物序列

表2 反應(yīng)程序

2.5western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase-3，Caspase-9蛋白表達(dá)水平

將細(xì)胞從6孔板上消化下來(lái)后，加入細(xì)胞裂解液，裂解H9c2細(xì)胞，4 ℃離心后，取上清液即為蛋白樣品，在收集的蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱3 min。冷卻到室溫后，上樣及電泳，電泳完成后，用PVDF膜轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，加入5%BSA封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60 min。封閉完成后將條帶放入到含一抗的自封袋中，4 ℃過(guò)夜。第二天取出后放入TBST中清洗5～10 min。共清洗3次。清洗完成后將膜放入含二抗的自封袋中，室溫在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育1 h。孵育完成后，TBST清洗，共清洗3次。之后加入顯影液，上機(jī)檢測(cè)條帶，讀取灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 黃芪多糖對(duì)硫酸吲哚酚誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，硫酸吲哚酚組的細(xì)胞活力顯著降低，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而與模型組比較，黃芪多糖50、100、200 μgl/mL給藥組細(xì)胞活力明顯升高，差異均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 黃芪多糖對(duì)硫酸吲哚酚誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力的影響

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

3.2 黃芪多糖對(duì)硫酸吲哚酚誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，硫酸吲哚酚組的ROS水平顯著上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖50、100、200 μgl/mL給藥組細(xì)胞內(nèi)ROS明顯下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 黃芪多糖對(duì)硫酸吲哚酚誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.3 各組心肌細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9mRNA的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，硫酸吲哚酚組的Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)水平均上升，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖50、100、200 μgl/mL給藥組中Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)水平均明顯下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表5。

分組Caspase-3/GAPDHCaspase-9/GAPDH空白對(duì)照組1.02±0.261.00±0.04硫酸吲哚酚組6.10±0.17**5.11±0.56**硫酸吲哚酚+黃芪多糖50μg/mL組4.22±0.14△△3.23±0.11△△硫酸吲哚酚+黃芪多糖100μg/mL組4.07±0.18△△2.28±0.14△△硫酸吲哚酚+黃芪多糖200μg/mL組3.78±0.34△△1.69±0.02△△

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

3.4 各組心肌細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá)水平

western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，硫酸吲哚酚組的Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達(dá)水平均上升，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖50、100、200 μgl/mL給藥組中Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達(dá)水平隨著黃芪多糖濃度的增加呈逐漸下降的趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表6。

注：A為空白對(duì)照組；B為硫酸吲哚酚組；C為硫酸吲哚酚+黃芪多糖50 μg/mL組；D為IS+黃芪多糖100 μg/mL組；E為IS+黃芪多糖200 μg/mL組。

圖1 各組心肌細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá)區(qū)別

分組Caspase-3/β-actinCaspase-9/β-actin對(duì)照組0.29±0.070.41±0.15硫酸吲哚酚組0.64±0.04**0.83±0.25**硫酸吲哚酚+黃芪多糖50μg/mL組0.43±0.07△△0.53±0.12#硫酸吲哚酚+黃芪多糖100μg/mL組0.36±0.04△△0.46±0.05#硫酸吲哚酚+黃芪多糖200μg/mL組0.35±0.05△△0.43±0.09##

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

尿毒癥毒素的積累是CKD進(jìn)展的標(biāo)志之一。由于CKD本質(zhì)上是一種進(jìn)行性疾病，如果不采取干預(yù)措施，尿毒癥毒素的滯留會(huì)隨著時(shí)間的推移而惡化，從而加劇CVD的發(fā)生，最終引發(fā)死亡。由此可見(jiàn)尿毒癥毒素是CVD的罪魁禍?zhǔn)?。而IS屬于可與蛋白質(zhì)結(jié)合小分子尿毒素，它通過(guò)與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，以增強(qiáng)其他尿毒癥毒素的作用，加速腎衰竭及其他由尿毒癥毒素引發(fā)的損害，如尿毒癥毒素所帶來(lái)的心腦血管損害[6]。根據(jù)吳禹池等[9]的研究，IS對(duì)心血管的損傷在于：使血管發(fā)生不同程度的鈣化；使心肌細(xì)胞間的膠原增生和導(dǎo)致細(xì)胞肥大；使血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能發(fā)生障礙。其中，IS通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。與此同時(shí)，有研究表明，ROS的過(guò)量累積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]，它同時(shí)也是監(jiān)測(cè)氧化損傷的重要指標(biāo)[10]。除此之外，根據(jù)線粒體凋亡途徑的理論，當(dāng)細(xì)胞凋亡開(kāi)啟后，凋亡信號(hào)會(huì)引起線粒體釋放出細(xì)胞色素C，釋放出的細(xì)胞色素C與胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合之后能活化Caspase-9，并進(jìn)一步活化凋亡通路的下游分子Caspase-3，從而介導(dǎo)一系列的細(xì)胞凋亡過(guò)程[11]。

由于IS引起的氧化應(yīng)激能夠?qū)е滦募〖?xì)胞損傷，最終引發(fā)心血管病變。因此，尋找有效藥物抑制IS引起的氧化應(yīng)激損傷將意義重大。而中醫(yī)中藥作為人類文化的瑰寶，解決這一難題的潛力巨大。黃芪作為一味歷史悠久的中藥，它的有效成分以及藥用價(jià)值被廣泛關(guān)注。其中，黃芪經(jīng)過(guò)提取分離得到的黃芪多糖，被證實(shí)有眾多功效：①免疫調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用[12]；②抗衰老作用[13]；③保護(hù)心血管[14]等作用。其中，王意蘭[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明黃芪多糖能夠減少心肌組織氧自由基的表達(dá)，調(diào)節(jié)組織中抗氧化系統(tǒng)的功能及平衡氧化系統(tǒng)，從而發(fā)揮心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，即減少心肌細(xì)胞的凋亡。

本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)黃芪多糖的抗氧化損傷，減少細(xì)胞凋亡的作用，利用不同濃度的硫酸吲哚酚對(duì)H9c2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)水平，及細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明硫酸吲哚酚可能通過(guò)引起氧化應(yīng)激從而誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷，而黃芪多糖可能通過(guò)降低ROS水平，以及降低H9c2細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9基因及蛋白表達(dá)水平，從而改善硫酸吲哚酚對(duì)H9c2細(xì)胞的損傷，起到保護(hù)H9c2細(xì)胞的作用。