劉婷 賴惠婷 郭夏娜

1深圳市寶安中醫(yī)院（集團）/廣州中醫(yī)藥大學附屬寶安中醫(yī)院檢驗科（廣東深圳518133）；2深圳市寶安區(qū)慢性病防治院檢驗科（廣東深圳518100）

2018年，全球確診為結核病患者中對利福平耐藥的患者從2017年的41%上升到51%[1]。由于多藥耐藥結核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）和廣泛耐藥結核?。╡xtensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）的與日劇增，對結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）耐藥檢測手段的局限和治療上困難，使病程向慢性化發(fā)展。有證據(jù)表明結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）能在肺空洞中躲避免疫因子的作用并只對抗菌藥物有較低的可接觸性，從而為耐藥性的發(fā)展提供了完美的條件[2]?？梢奙TB感染人體的轉歸在很大程度上取決于人體免疫狀態(tài)[3]。免疫功能低下可能是是導致結核病感染慢性化且出現(xiàn)耐藥的原因之一，因此，本研究選擇研究MTB耐藥的免疫學機制，試圖從CD8+T淋巴細胞（CD8+T lymphocytes，CTL）為切入點初步探索它們在MTB耐藥免疫學機制中的作用，以期為耐藥結核病的臨床免疫診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象選擇2016年2月至2017年9月就診于深圳市寶安區(qū)慢性病防治院，經Ⅹ光檢查，痰涂片抗酸桿菌檢查，痰結核桿菌培養(yǎng)結合臨床癥狀確診為初治肺結核患者56例，根據(jù)痰標本的XpertgeneMTB/RIF檢測結果初步分為原發(fā)性耐藥組和非耐藥組。耐藥組（異煙肼和利福平雙重耐藥）26例，其中男16例，女9例，平均年齡（34.92±11.14）歲；非耐藥組（無耐藥現(xiàn)象）30例，其中男18例，女12例，平均年齡（33.62±9.93）歲。健康對照組為寶安區(qū)健康體檢中心的健康體檢者30例，其中男18例，女12例，平均（35.38±7.94）歲。對各組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。根據(jù)實驗需要，分別有以下研究對象：經自身MTB刺激的耐藥組巨噬細胞（RMTBRMAC）、經自身MTB刺激的非耐藥組巨噬細胞（SMTBSMAC）、未經MTB刺激的健康對照組巨噬細胞（NMac）、耐藥組CTL（RCTL）、非耐藥組CTL（SCTL）以及健康對照組CTL（NCTL）。

1.2 實驗材料、試劑淋巴細胞分離液為天津灝洋生物公司產品，完全RPMI-1640細胞培養(yǎng)液為美國Gibco公司產品，臺盼藍染液為北京Solarbio公司產品，穿孔素（perfoin）、顆粒酶B（GranB）、顆粒溶素（Granu）及TLR2的ELISA檢測試劑盒為武漢伊萊瑞特生物公司產品，Caspase-3分光光度法檢測試劑盒為南京凱基生物公司產品，MB-580型酶標儀和PW-960G型洗板機為深圳匯松公司產品[4]。

1.3 研究方法

1.3.1 MTB分離與培養(yǎng)于藥物干預前根據(jù)XpertgeneMTB/RIF檢測結果收集耐藥組和非耐藥組MTB，于羅氏培養(yǎng)基37℃，5%CO2至對數(shù)生長期，收集菌株，貯存于-70℃。待痰結核桿菌培養(yǎng)和比例法藥物敏感試驗結果出來后，根據(jù)比例法和Xpert gene結果進一步細化實驗分組：兩者結果均耐藥者納入耐藥組（結核菌藥敏試驗至少對利福平、異煙肼耐藥）；兩者結果均敏感者納入非耐藥組；兩者結果不一致者不納入實驗研究范圍。每組選取10例臨床結核桿菌分離株（如分組時各組大于10例，采取隨機數(shù)字表隨機抽樣方法選出10菌株）。

1.3.2 各免疫細胞的分離于藥物干預前抽取各組患者EDTA抗凝血6 mL，分離出PBMC，后者進一步分離出巨噬細胞（Mac）和CD8+T淋巴細胞（經抗原刺激活化后即為CTL[5]），體外培養(yǎng)至對數(shù)生長期，凍存于-196℃液氮罐中，待MTB培養(yǎng)出后根據(jù)細胞生長狀態(tài)選擇生長良好的10株細胞株進行進一步的實驗（如大于10株，隨機數(shù)字表隨機抽樣10株細胞）。

1.3.3 MTB抗原制備收集耐藥組和非耐藥組MTB菌株，于羅氏培養(yǎng)基37℃，5%CO2至對數(shù)生長期，收集菌株，用無菌PBS洗滌3次后，重懸于PBS。于80℃加熱1 h滅菌，用無菌PBS調整細菌濃度至1×106/mL），貯存于-20℃，備用。此菌懸液包含有MTB的可溶性和顆粒性抗原。

1.3.4 檢測不同CTL經各組MTB-Ag刺激后分泌各種細胞毒分子的能力于12孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入各組Mac（2×105個/mL）及相應組MTB-Ag 1 mL[即耐藥組MTB+耐藥組Mac（RMTB-RMac）、非耐藥組MTB+非耐藥組Mac（SMTB-SMac），同時設立未加菌株的健康對照組Mac空白對照（NMac）]培養(yǎng)18 h后，在培養(yǎng)板中每孔加入各組CTL（2×106cells/mL）1 mL，具體實驗分組情況如下：SCTL+SMTB-SMac、SCTL+RMTB-RMac、SCTL+NMac、RCTL+SMTB-SMac、RCTL+RMTB-RMac、RCTL+NMac、NCTL+SMTB-SMac、NCTL+RMTB-RMac、NCTL+NMac。上述各組再繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，收集各孔細胞上清液，用ELISA分別檢測各上清液中穿孔素、顆粒酶B、顆粒溶素水平。每份標本同時平行檢測3次。

1.3.5 檢測不同CTL對各組Mac凋亡的影響12孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入各組Mac（2×105cells/mL），待其貼壁后加入相應組MTB-Ag 1 mL[即耐藥組MTB+耐藥組Mac（RMTB-RMac）、非耐藥組MTB+非耐藥組Mac（SMTB-SMac）]，培養(yǎng)18 h后，在培養(yǎng)板中每孔加入各組CTL 1 mL（2×106個/mL），具體實驗分組情況如下：SCTL+SMTB-SMac、RCTL+SMTB-SMac、SCTL+RMTB-RMac、RCTL+RMTB-RMac、SMTB-SMac對照、RMTB-RMac對照。上述各組再繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去除CTL細胞，清洗Mac兩次后，加入完全RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細胞上清及Mac細胞。消化收集各實驗組內貼壁的Mac，調整細胞濃度為1×105個/mL，按照南京凱基公司的化學發(fā)光法Caspase-3檢測試劑盒說明書操作檢測各組Mac中Caspase-3水平；收集細胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測各組巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TLR2濃度水平。

1.4 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0及GraphPad Prism7.6軟件進行分析，計量資料組間差異采用兩因素方差分析及獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型構建體外模擬耐藥組及非耐藥組MTB患者體內環(huán)境，成功構建MTB-Ag+Mac+CTL的細胞模型后，檢測了經耐藥組及非耐藥組MTB-Ag刺激后各組CTL細胞培養(yǎng)上清中穿孔素，顆粒酶B和細胞溶素的水平及兩組MTB-Ag刺激后Mac上凋亡指標TLR2與Caspase-3的水平。見圖1、2。

圖1 不同MTB-Ag刺激后各組細胞毒分子水平Fig.1 RCTL express lower levels of different groups after adifferent MTB-Ag stimulated

2.2 不同MTB-Ag刺激后各種CD8+T淋巴細胞細胞毒分子水平

2.2.1 耐藥患者CTL經自身MTB-Ag刺激后分泌細胞毒分子的能力低于非耐藥患者CTLRCTL+RMTB-RMac組上清液中三種細胞毒分子水平小于SCTL+SMTB-SMac（穿孔素t=16.960，P＜0.001；顆粒酶Bt=10.953，P＜0.001；顆粒溶素t=24.611，P＜0.001）。除顆粒酶B（t=1.704，P=0.106）外，RCTL+RMTB-RMac組穿孔素（t=3.529，P=0.004）、顆粒溶素水平小于 NCTL+NMac組（t=12.898，P＜0.001）。見圖1。

2.2.2 耐藥組CTL經不同MTB-Ag刺激后分泌細胞毒分子的水平RCTL+SMTB-SMac、RCTL+RMTB-RMac和RCTL+NMac組的培養(yǎng)上清液中各細胞毒分子水平除去顆粒酶B（F=6.119，P=0.006）以外，穿孔素（F=0.497，P=0.614）、顆粒溶素水平沒有差異（F=1.779，P=0.188）。見圖1。

2.2.3 三種細胞毒分子的分泌水平非耐藥組CTL經耐藥MTB-Ag刺激后，分泌三種細胞毒分子的能力顯著高于耐藥組CTL。雖然SMTB-SMAC及RMTBRMAC均能刺激SCTL上穿孔素，顆粒酶B和顆粒溶素高水平表達，SCTL+RMTB-RMAC組中細胞培養(yǎng)上清液中這些細胞毒分子水平卻明顯低于SCTL+SMTB-SMAC（穿孔素t=6.513，P＜0.001；顆粒酶 Bt=2.558，P=0.02；顆粒溶素t=3.822，P=0.001），可同時又顯著高于RCTL+RMTB-RMAC（穿孔素t=14.722，P＜0.001；顆粒酶Bt=5.397，P＜0.001；顆粒溶素t=20.293，P＜0.001）。SCTL與SMTB-SMac，RMTB-RMac，NMac共培養(yǎng)后穿孔素、顆粒酶B和顆粒溶素高水平表達，顯著高于RCTL及NCTL組（均P＜0.0001）。見圖1。

2.3 不同MTB-Ag及CTL對各組巨噬細胞上凋亡指標TLR2與Caspase-3的影響

2.3.1 經不同MTB-Ag刺激后不同組巨噬細胞的TLR2與Caspase-3水平不同組Mac經相應的MTB-Ag刺激后，結果發(fā)現(xiàn)，耐藥組Mac（RMTB-RMac）的 TLR2（t=4.538，P＜0.001），Caspase-3（t=18.136，P＜0.001）水平均小于非耐藥組（SMTBSMac）。非耐藥組CTL對相應組SMTB-SMac的TLR2，Caspase-3刺激作用高于耐藥組CTL。SCTL+SMTBSMac與 RCTL+RMTB-RMac相比，TLR2（t=10.030，P＜0.001）、Caspase-3有差異（t=18.136，P＜0.001）。見圖2。

圖2 不同MTB-Ag及CTL對各組Mac上凋亡指標TLR2與Caspase-3的影響Fig.2 The effect of different MTB-Ag and CTL on the level of TLR2 and Caspase-3 on macrophage

2.3.2 非耐藥病人體外模型與耐藥病人模型結果比較非耐藥組CTL對相應組SMTB-SMac的TLR2，Caspase-3刺激作用高于耐藥組CTL。SCTL+SMTB-SMac與 RCTL+RMTB-RMac相比，TLR2（t=10.030，P＜0.001）、Caspase-3差異具有顯著統(tǒng)計學意義（t=18.136，P=0.000）。見圖2。

2.3.3 非耐藥組CTL能提高耐藥組RMTB-RMac的TLR2與Caspase-3表達水平SCTL+RMTB-RMac的TLR2（t=6.484，P＜0.001），Caspase-3（t=7.657，P＜0.001）顯著高于RMTB-RMac，也顯著高于RCTL+RMTB-RMac[TLR2（t=6.874，P＜0.001），Caspase-3（t=9.206，P＜0.001）]。見圖2。

3 討論

目前，對結核病的免疫學研究多以CD4+T淋巴細胞為主[5]，對CTL在抗結核中的作用關注甚少。越來越多的證據(jù)表明CTL在對抗MTB免疫中亦發(fā)揮了非常重要的作用[6]。在人MTB感染中，MTB特異性CTL活化在MTB感染4周內就已產生并且能持續(xù)至少9個月。

在特異性免疫應答中，巨噬細胞將MTB抗原通過MHC-I類分子提呈給CTL，后者釋放溶細胞分子如穿孔素，顆粒酶及顆粒溶素，穿孔素先在細胞膜上打孔以便顆粒酶或顆粒溶素進入細胞成分[6]，一旦進入靶細胞，顆粒酶A和B及顆粒溶素，通過Caspase途徑觸發(fā)受感巨噬細胞的凋亡并直接攻擊感染細胞中內體/溶酶體中的MTB來減少其生長。

已發(fā)現(xiàn)慢性肺結核的發(fā)展與感染部分CTL穿孔素和顆粒溶素的減少有關，后者的減少又與CTL成熟障礙相符合[7]，說明這些溶細胞分子的增加與MTB生長控制是有關的。而且研究發(fā)現(xiàn)缺少了穿孔素的CTL細胞毒功能減弱。這些已有研究證明在宿主CTL對MTB的免疫過程中，穿孔素，顆粒酶等溶細胞分子誘導受感巨噬細胞凋亡起到了關鍵作用。

本研究觀察到耐藥MTB刺激其耐藥組Mac后再與耐藥組CTL（RCTL+RMTB-RMac）共培養(yǎng)后，其分泌三種細胞毒分子水平均顯著低于非耐藥組（SCTL+SMTB-SMac）。說明耐藥結核患者體內分離出的CTL細胞分泌細胞毒分子的功能確實較非耐藥組弱。并且即使是在體外培養(yǎng)，耐藥MTB也對CTL的分泌能力起到抑制作用。GEFFNER等[8]研究發(fā)現(xiàn)MTB耐藥菌株M在體外只能激活極低的CTL活性，且脫顆粒信號CD107減少，其后續(xù)報道[9]指出經菌株M刺激的健康自愿者CTL僅表現(xiàn)出少量的溶細胞分子和CCL5表達。

本研究發(fā)現(xiàn)正常對照組CTL與其相應巨噬細胞（NCTL+NMac）培養(yǎng)后其上清液中也可檢測出少量的溶細胞分子水平，推測是由于自身抗原（如體內衰老死亡的紅細胞等）被Mac吞噬后引起的一種微弱的免疫反應，但不足以引起機體的免疫應答。然而RCTL+RMTB-RMac組各溶細胞分子的水平與正常對照組無差別，甚至小于正常對照組，說明耐藥結核患者機體的免疫應答水平極低，甚至低于正常健康時的免疫耐受狀態(tài)，這可能是由于耐藥結核病患者體內Mac無法正常識別或處理MTB-Ag肽并提呈給CTL引起，也有可能是由于CTL功能缺陷，無法正常分泌細胞毒分子引起的。RCTL作用于SMTB-SMac，RMTB-RMac，Mac空白對照后，其分泌穿孔素與顆粒溶素水平組間差異無統(tǒng)計學意義，這可能由于耐藥結核病患者CTL細胞功能受損，在體外單獨培養(yǎng)后，也保持免疫缺陷特性，即使是非耐藥MTB-Ag刺激，也無法使RCTL發(fā)揮正常的細胞毒作用。RCTL經SMTB-SMac和對照組NMac刺激后各細胞毒分子分泌水平不僅顯著低于SCTL組，甚至明顯低于NCTL組，特別就顆粒溶素，分泌量極低，這進一步說明耐藥MTB患者CTL細胞免疫功能受損，其細胞毒活性遠低于非耐藥MTB患者，且低于正常健康人群。

非耐藥組患者外周血中CTL與不同MTB-Ag共培養(yǎng)后，其分泌細胞毒分子水平都顯著高于耐藥組和正常組CTL，說明非耐藥結核患者體內的免疫狀態(tài)良好，并被積極調動參與到機體對MTB的防御中，即使是在體外培養(yǎng)，SCTL仍能發(fā)揮良好的細胞毒作用。當耐藥患者MTB-Ag體外刺激相應Mac，再與非耐藥MTB患者CTL細胞共培養(yǎng)（SCTL+RMTB-RMac），發(fā)現(xiàn)其對SCTL細胞毒作用的激活能力確實較SMTB-SMac組（SCTL+SMTB-SMac）弱。這可能就由于耐藥MTB患者其自身Mac在分離之前已經出現(xiàn)免疫損傷，其抗原攝取，處理及提呈MTB-Ag過程中某個環(huán)節(jié)能力減弱，或者是均有所損傷，從而導致耐藥MTB患者的MTB-Ag肽對SCTL的刺激強度不夠；或者與CTL結合能力受損，導致其刺激SCTL分泌細胞毒分子的能力較非耐藥MTB患者的Mac弱。同時，SCTL+RMTB-RMac的穿孔素，顆粒酶B和顆粒溶素雖然低于SCTL+SMTB-SMac，卻遠遠高于RCTL+RMTB-RMac組，甚至其顆粒溶素及顆粒酶的分泌量還高于NCTL+RMTB-RMac。說明即便是耐藥患者Mac可能存在功能受損，能夠提呈的MTB-Ag肽有限，SCTL也能對這有限的耐藥MTB-Ag刺激產生良好免疫應答。

耐藥組Mac上TLR2及Caspase-3水平顯著低于非耐藥者，其誘導自身凋亡能力減弱。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）為膜結合的一類模式識別受體（pattern recognize receptors，PRRs），TLR2在抗結核中發(fā)揮重要作用。結核分枝桿菌能通過抑制免疫應答來增強其在巨噬細胞的存活期，有部分原因是因為它復雜的細胞壁結構。結核桿菌的脂蛋白能被TLR2識別激活固有免疫細胞，介導抗分枝桿菌適應性免疫，巨噬細胞內P38磷酸化和細胞因子的產生都依賴于TLR2[10]。有研究發(fā)現(xiàn)MTB刺激的TLR2能在P38MAPK（p38 mitogenactivatedprotei kinase）持續(xù)磷酸化的作用下增強ROS產物，ROS可以通過Caspase途徑引起細胞凋亡。移植了已感染MTB的預凋亡Mac后可以增強T細胞免疫并控制感染[11]，感染了MTB細胞的凋亡可以增強對細胞內細菌復制的控制并增強特異性CD8+T細胞應答，后者需要凋亡Mac提呈相應MTB抗原，而前面已述CTL可以通過分泌溶細胞分子經Caspase途徑促進Mac凋亡。

筆者發(fā)現(xiàn)SMTB-SMac上清液中TLR2及Caspase-3水平明顯高于RMTB-RMac，說明非耐藥組巨噬細胞較耐藥組巨噬細胞能更高水平地表達TLR2及Caspase-3，進而更好的識別，吞噬MTB-Ag并提呈給CTL，并且能更好地促進已吞噬了MTB的巨噬細胞的凋亡；在SMTB-SMac，RMTB-RMac分別加入相應CTL后，發(fā)現(xiàn)SCTL+SMTB-SMac細胞上清液中TLR2（t=6.735，P＜ 0.001）及Caspase-3（t=5.602，P＜0.001）水平明顯高于SMTB-SMac，而RCTL+RMTB-RMac與，RMTBRMac沒有統(tǒng)計學意義（TLR2（t=1.536，P=0.142）Caspase-3（t=0.089，P=0.930），這反應出可能在耐藥結核患者機體內RCTL并不能上調對Mac表達TLR2，但是非耐藥結核患者的SCTL具有這種正向調節(jié)能力。SCTL+SMTB-SMac與RCTL+RMTB-RMac相比較更是差異顯著。說明SCTL與吞噬了SMTB的巨噬細胞結合后，可以上調其表達TLR2，更有助于后者將MTB-Ag提呈給SCTL，發(fā)揮SCTL細胞免疫功能。以上兩點進一步說明在非耐藥結核患者體內無論是CTL還是Mac的細胞免疫功能都高于耐藥結核患者。

同時，在實驗中觀察到SCTL作用于RMTB-RMac（SCTL+RMTB-RMac）后，后者 TLR2與Caspase-3水平明顯較RCTL+RMTB-RMac提高。因此筆者大膽推測SCTL能夠促進RMTB-RMac的自身凋亡，從而達到殺傷清除吞噬在其內體中的耐藥MTB。

綜上，經耐藥MTB-Ag致敏的耐藥CTL細胞分泌穿孔素，顆粒酶B和細胞溶素的能力及其Mac上TLR2和Caspase-3表達確實顯著低于非耐藥MTB-Ag致敏的SCTL，說明耐藥MTB的耐藥特性與其能使CTL活性受損且不能有效誘導巨噬細胞凋亡，進而逃避機體的免疫應答有一定關系；同時實驗發(fā)現(xiàn)將非耐藥肺結核患者的CTL與耐藥MTB-Ag共同培養(yǎng)后上述溶細胞分子分泌水平明顯高于耐藥患者的CTL，且耐藥Mac上TLR2和Caspase-3表達也大幅提高。當然，本實驗僅僅是對異煙肼和利福平雙重耐藥肺結核患者的CTL的抗結核免疫功能作了一個初步探討，其具體還涉及到哪些免疫分子和信號傳導通路，尚未可知，還有待進行一步研究。