喬國(guó)華 ，索朗達(dá)，吳玉江，德 吉，巴 貴，次仁德吉，解鐵民，肖志剛，陳興月

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧研究所，西藏拉薩 850000）

湖羊是中國(guó)代表性綿羊品種，產(chǎn)羔率在200%以上，一胎多羔。母乳通?？梢晕桂B(yǎng)1～2 羔，其他1～2 羔將死于饑餓[1]，因此實(shí)際生產(chǎn)中多采用人工飼喂以免于羔羊死亡。人工飼喂羔羊常用牛乳或重新調(diào)配的代乳粉，但由于其乳糖含量較高（35%～39%），羔羊死于真胃臌氣的比例超過(guò)5%[2]。研究證明，羊乳與牛乳的成分差別很大，羊乳粉的乳糖含量（一般為25%）比牛乳低，乳脂肪比牛乳高（32% vs 28%），乳蛋白比牛乳高（30%vs 26%）[3-6]。初生羔羊非常容易受到很多環(huán)境因素影響，如低溫和病原微生物。為抵抗這些病原微生物，土霉素等抗生素被廣泛用做飼料藥物添加劑，但使用抗生素產(chǎn)生耐藥菌株等問(wèn)題引發(fā)關(guān)注，無(wú)抗飼養(yǎng)成為大勢(shì)所趨。中草藥作為綠色飼料添加劑，在牛、羊、豬、雞的養(yǎng)殖上得到廣泛應(yīng)用。早期研究證明，女貞子有改善育成期奶牛免疫狀態(tài)的作用，可提高血漿中免疫球蛋白G和免疫球蛋白E[7]。添加女貞子也能夠提高綿羊血液抗氧化功能[8]。本試驗(yàn)旨在研究羔羊奶粉添加女貞子對(duì)羔羊生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能的影響，為女貞子在將來(lái)無(wú)抗飼養(yǎng)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 女貞子粉制取 女貞子果實(shí)購(gòu)于沈陽(yáng)同仁堂藥店，用微膠囊技術(shù)進(jìn)行處理以增加其懸浮性。女貞子果實(shí)在65℃烘箱中烘干48 h。冷卻到室溫時(shí)，用藥物專用粉碎機(jī)粉碎（HK1100B，哈爾濱制藥六廠），過(guò)100目篩。流體床（Type TL-GHX-IIα，江蘇）對(duì)女貞子粉末制粒。具體參數(shù)：床扇速度1 150 r/min，泵速7 min-1，霧化壓力0.16 MPa，物料溫度40～45 ℃，制粒時(shí)間45 min。5.0% 麥芽糊精（w/v）和0.15% 黃原膠（w/v）用作粘合劑。制粒后取樣，用高效液相色譜測(cè)定熊果酸（OA）和齊墩果酸（UA）含量（Waters Technologies Inc.，USA）。0.5 g 粉末溶解于25 μL 甲醇。超聲波提取30 min 并且用0.4 μm 濾膜過(guò)濾。取1μm 進(jìn)樣。色譜柱子為 ACE EXCEL 3 μm Super C18，50 mm×2.1 mm柱子，條件：40℃，流速0.42 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水，含有0.1%磷酸（52:33:15，三乙胺調(diào)整pH 到6.5）；雄果酸和齊墩果酸的出峰時(shí)間分別為11.51 min 和12.31 min。女貞子粉顆粒13.263 mg/gOA和2.771 mg/gUA。土霉素購(gòu)自于Bayer-Sino 公司（德國(guó)）。

1.2 代乳粉試驗(yàn) 在山東省莘縣天牧母羊飼養(yǎng)場(chǎng)進(jìn)行。母羊飼喂全混合日糧（TMR），精粗比為65:35（干物質(zhì)基礎(chǔ)），自由采食。粗飼料為羊草和黃貯，各占50%。精飼料含有粗蛋白質(zhì)217 g/kg，總可消化養(yǎng)分為736 g/kg，由北京三元禾豐牧業(yè)有限公司提供。選擇泌乳日齡為5～55 d 的第2 胎母羊60 只分析其乳成分（NIR，Milko-Scan 133B；Foss Electric，DK-3400 Hiller?d，Denmark）。水分和灰分采用AOAC（1997）的方法。每只母羊乳取5 mL，混合60 只母羊乳，凍干，原子吸收法分析常量元素Ca、Mg、Na、K 含量和微量元素Zn、Mn、Co、Fe、Cu、Se 含量（AAS-3000，DAFURY，北京）。湖羊母羊乳蛋白、乳脂肪和乳糖含量分別為4.45%、5.58%和4.58%。代乳粉配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇3 日齡羔羊90 只（從母羊分離），隨機(jī)分成3 組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6 只羔羊，公、母各半。對(duì)照組為代乳粉組，女貞子粉組飼喂為代乳粉+30 g/kg 女貞子粉），土霉素組為代乳粉+1 g/kg 土霉素。每個(gè)重復(fù)羔羊單欄人工飼養(yǎng)。試驗(yàn)期為2017 年5 月10 日—2017 年6 月26 日，期間平均環(huán)境溫度為14.9～19.8℃。

1.4 飼喂管理 選定的羔羊打耳標(biāo)并精確稱重。每周用ClO2對(duì)所有圍欄消毒1 次。代乳粉在36℃蒸餾水條件下按照16.7%（w/v）比例進(jìn)行混合。采用自制喂奶器進(jìn)行飼喂。每個(gè)喂奶器上安裝有6 個(gè)人工乳頭。初生1～3 d 采食初乳（免疫球蛋白濃度在5 000～8 000 mg/100mL）；第4～10 天每天飼喂4 次，每次25 g 代乳粉；第11～18 天每天飼喂3 次，每次38 g 代乳粉；第19～46 天每天飼喂2 次，每次50 g 代乳粉；第46 天斷奶；自由飲水，第4 天開(kāi)始自由采食紫花苜蓿和精飼料（北京三元禾豐牧業(yè)有限公司）。精補(bǔ)料（不添加藥物）為顆粒飼料：55%粉碎玉米，14%粉碎燕麥，25%粉碎大麥，5%甜菜糖蜜和1%預(yù)混料。每千克精補(bǔ)料含有代謝能12.17 MJ，蛋白質(zhì)105 g，鈣1.5 g，維生素A 6 500 IU，維生素D31 000 IU，維生素E 75 mg 和硒0.3 mg。記錄每天紫花苜蓿和顆粒飼料的采食量。每天觀察羔羊的健康、腹瀉和真胃臌氣情況。羔羊尾根處有明顯糞污視為腹瀉，腹瀉率=組內(nèi)腹瀉羔羊數(shù)/ 組中羔羊數(shù)×100%。羔羊腹部有明顯充氣（鼓肚子）視為真胃臌氣。

表1 代乳粉配方組成及營(yíng)養(yǎng)成分（濕基）

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 血樣及血液指標(biāo) 分別在10、17、24、31 日齡晨飼前對(duì)每個(gè)重復(fù)3 只羔羊頸靜脈采血。血液樣品在37℃水域斜面條件下靜置1.5 h。取上清液儲(chǔ)存于-20℃冰箱中待測(cè)。血清IgA 和IgG 和IgM 用ELISA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定（Montgomery，TX，USA）。前列腺素（PGE2）和可的松采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定（上海酶聯(lián)科技有限公司）。血清IL-1β、IL-6 和IL-8 采用ELISA 試劑盒進(jìn)行 測(cè) 定（Groundwork Biotechnology Diagnosticate，San Diego，CA，USA）。血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定（北京索萊寶科技有限公司）。

1.5.2 體尺及體重 根據(jù)Adebayo[9]的方法在46 日齡測(cè)定體重和體尺，體尺指標(biāo)包括肩胛高度、尻高度、體長(zhǎng)和胸圍。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 9.1 軟件中One-Way ANOVA過(guò)程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。羔羊腹瀉率和腹瀉天數(shù)采用卡平方χ2檢驗(yàn)。顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 添加女貞子對(duì)羔羊腹瀉和真胃臌氣的影響 從表2可以看出，試驗(yàn)期內(nèi)所有羔羊無(wú)死亡現(xiàn)象。對(duì)照組羔羊的腹瀉率和腹瀉天數(shù)分別70% 和46 d，高于女貞子組和土霉素組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊沒(méi)有真胃臌氣發(fā)生。

表2 添加女貞子對(duì)羔羊腹瀉率，死亡和真胃臌氣的影響

2.2 添加女貞子對(duì)羔羊飼料采食量、體重和體尺指標(biāo)的影響 從表3 可以看出，女貞子組和土霉素組羔羊的精飼料采食量都高于對(duì)照組（P＜0.05）。女貞子組羔羊的紫花苜蓿采食量高于其他2 組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊的末重和平均日增重均高于對(duì)照組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊的肩胛高度、尻高度、體長(zhǎng)和胸圍均高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 添加女貞子對(duì)羔羊血液免疫球蛋白和白細(xì)胞介素的影響 如表4 所示，土霉素組和女貞子組羔羊17、24 日齡血液IgG 濃度高于對(duì)照組（P＜0.05），女貞子組和土霉素組羔羊的IgG 濃度無(wú)顯著差異。代乳粉中加入女貞子或土霉素在整個(gè)試驗(yàn)期并未改變羔羊的血液IgE 和IgA 濃度（P＞0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊17、24、31 日齡血液IL-1β、IL-6 和IL-8 濃度均較對(duì)照組低（P＜0.05）。

表3 添加女貞子對(duì)羔羊采食量、體重和體尺指標(biāo)的影響

表4 女貞子對(duì)人工飼喂羔羊免疫的影響

2.4 添加女貞子或者土霉素對(duì)羔羊應(yīng)激激素的影響 從表5 可以看出，女貞子組和土霉素組羔羊24、31 日齡血液可的松、PGE2濃度均低于對(duì)照組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊的可的松濃度和PGE2濃度無(wú)顯著差異。

表5 女貞子對(duì)人工飼喂羔羊應(yīng)激激素的影響

2.5 添加女貞子對(duì)羔羊血液抗氧化功能的影響 如表6所示，女貞子組和土霉素組羔羊24、31 日齡血液SOD濃度均高于對(duì)照組（P＜0.05）。女貞子組和土霉素組羔羊17、31 日齡血液MDA 濃度低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表6 女貞子對(duì)人工飼喂羔羊抗氧化功能的影響

3 討 論

3.1 代乳粉對(duì)真胃臌氣率和腹瀉率的影響 關(guān)于代乳粉對(duì)山羊羔羊的生長(zhǎng)、消化和代謝的影響已有較多研究報(bào)道。鮮有針對(duì)于綿羊羔羊進(jìn)行的試驗(yàn)研究。Anderson 等[3]報(bào)道，綿羊乳成分與山羊乳成分有很大區(qū)別。綿羊乳的乳蛋白和乳脂肪高于山羊，而乳糖低于山羊[4-6]。Pulina等[10]報(bào)道，Sarda 母羊（意大利綿羊）乳中脂肪和蛋白質(zhì)分別達(dá)6.5%和5.8%。本試驗(yàn)所測(cè)得的湖羊乳蛋白、乳脂肪和乳糖含量分別為4.45%、5.58%和4.58%。這些結(jié)果說(shuō)明羊乳的成分構(gòu)成存在種屬特異性，山羊與綿羊乳成分有差異，而且不同品種綿羊的乳成分上也有差異。Edward 等[2]報(bào)道，臌氣是由似肉瘤細(xì)菌（Sarcina-like bacteria）引起，這種菌棲居在幼齡反芻動(dòng)物胃腸道中，對(duì)乳糖發(fā)酵速度較快，產(chǎn)生較多的氣體，引起臌氣。本試驗(yàn)制備的代乳粉中含25% 乳糖。而牛乳中的乳糖含量較高，一般為35%～39%。本試驗(yàn)使用的代乳粉營(yíng)養(yǎng)組分與母乳相近，可較好預(yù)防真胃臌氣的發(fā)生，這說(shuō)明羔羊真胃臌氣很有可能與代乳粉中乳糖比例有關(guān)。對(duì)照組羔羊較高的腹瀉率和較長(zhǎng)的腹瀉天數(shù)說(shuō)明代乳粉中添加女貞子粉或土霉素可較好預(yù)防羔羊腹瀉。

3.2 添加女貞子粉對(duì)羔羊采食量和生長(zhǎng)性能的影響 初生幼畜會(huì)受到一些環(huán)境致病菌（如大腸桿菌和真菌等）侵染。這個(gè)時(shí)期的家畜很容易處于應(yīng)激狀態(tài)，采食量降低，生產(chǎn)性能也隨之降低。本研究結(jié)果表明，對(duì)照組羔羊精飼料采食量和生產(chǎn)性能均有所下降，體尺指標(biāo)下降；而添加女貞子的代乳粉提高了羔羊紫花苜蓿的采食量，且體重和體尺指標(biāo)均較對(duì)照組有顯著提高。Qiao 等[7]試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加女貞子（100 g/d）提高了荷斯坦后備牛對(duì)纖維的采食量和消化率。這可能是由于女貞子粉提高了瘤胃內(nèi)纖維降解菌活性，從而提高了纖維的消化率。但需要進(jìn)一步用體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)這一論斷。

3.3 添加女貞子粉對(duì)羔羊免疫功能的影響 中草藥可以加強(qiáng)肉仔雞[11]、蛋雞[12]、仔豬[13-14]、綿羊[8]、后備牛[7]和奶牛[15]等動(dòng)物的免疫功能、提高血漿IgG 和IgA 濃度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3 個(gè)處理組羔羊24 日齡血漿IgG 濃度下降趨勢(shì)一致，31 日齡開(kāi)始提高。這與Lindsey 等[16]在犢牛上的研究結(jié)果一致。這一現(xiàn)象表明羔羊24 日齡內(nèi)的免疫功能主要來(lái)源于母乳中的IgG，屬于被動(dòng)免疫。而在31 日齡以后羔羊需要?jiǎng)訂T機(jī)體功能來(lái)建立自身的主動(dòng)免疫，合成自身的抗體。本試驗(yàn)中女貞子組和土霉素組的羔羊24 日齡前血漿IgG 的下降趨勢(shì)明顯低于對(duì)照組，表明添加女貞子粉或土霉素的代乳粉可以起到抵抗病原微生物和減少對(duì)母乳中IgG 消耗的作用。

熊果酸、齊墩果酸、二氫熊果酸和優(yōu)帕托林是女貞子的主要有效成分，尤其是熊果酸和齊墩果酸（均屬于五環(huán)三萜類羧酸）有抵抗病原菌、抗炎癥和降低IL-1β、IL-6 和TNF-α的作用[17-19]。本試驗(yàn)使用的女貞子果實(shí)中含有齊墩果酸和熊果酸的含量分別為2.77、13.26 mg/g。細(xì)胞因子（如IL-1β、IL-6 和IL-8）可反映機(jī)體免疫狀態(tài)，其中IL-1β是必需促炎癥因子，起到調(diào)控腫瘤細(xì)胞的作用，IL-6 是腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，而IL-8 是介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子[20]。Alejandra 等[17]報(bào)道，0.5 mg/kg 體重的熊果酸降低了炎癥因子IL-6 水平，提高了大鼠的免疫狀態(tài)。Seungye 等[18]報(bào)道，熊果酸顯著降低了炎癥反應(yīng)，伴隨著抑制促炎癥因細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-21 和IL-17 的表達(dá)，同時(shí)降低了氧化應(yīng)激標(biāo)記物——硝基酪氨酸和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)，結(jié)果NO合成量降低。Feng 等[19]進(jìn)一步在脂多糖誘導(dǎo)NO 炎癥大鼠的研究證實(shí)，齊墩果酸和熊果酸表現(xiàn)出了較高的抑制NO 合成的作用，其機(jī)理是抑制NO 合成，從而發(fā)揮抗擊炎癥的作用。從整個(gè)試驗(yàn)來(lái)看，對(duì)照組羔羊的IL-1β、IL-6 和IL-8 水平有所提高，而女貞子組和土霉素組羔羊17～31 日齡IL-1β、IL-6 和IL-8 水平顯著降低。這說(shuō)明對(duì)照組羔羊處于相對(duì)較差的免疫狀態(tài)，同時(shí)說(shuō)明女貞子是通過(guò)抑制炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-8 來(lái)提高羔羊的免疫狀態(tài)。女貞子是否可以抑制NO 合成，需要進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)。

3.4 添加女貞子對(duì)羔羊應(yīng)激激素的影響 在豬[21]、山羊[22]、母豬[23]上的研究發(fā)現(xiàn)，從母畜隔離的初生家畜會(huì)受到很多環(huán)境因素影響，其中包括病原微生物、低溫環(huán)境和代乳粉。這些應(yīng)激因素刺激來(lái)源于下丘腦-腎上腺軸的可的松和PEG2分泌，進(jìn)而降低精飼料采食量和生長(zhǎng)性能，并且使初生家畜的健康狀態(tài)和免疫狀態(tài)惡化。本試驗(yàn)中，對(duì)照組羔羊血清可的松和PGE2水平高于其他2個(gè)組，表明對(duì)照組羔羊處于較大程度上的應(yīng)激狀態(tài)。羔羊較低的采食量和較低生長(zhǎng)性能可能與應(yīng)激激素水平提高有關(guān)。

3.5 添加女貞子對(duì)羔羊抗氧化狀態(tài)的影響 相關(guān)研究指出，當(dāng)動(dòng)物處于較差的抗氧化狀態(tài)時(shí)，總是伴隨著低濃度的血液SOD 和/或GSH，和較高濃度的MDA，同時(shí)生產(chǎn)性能明顯降低[7,12]，血液SOD 和/或GSH、MDA（細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物）分別與動(dòng)物的抗氧化狀態(tài)呈正相關(guān)、負(fù)相關(guān)。由于細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的氧化使細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，造成生產(chǎn)性能降低[24]。熊果酸和齊墩果酸是女貞子的主要活性成分，有提高抗氧化和保護(hù)肝臟的作用[12]。Chen 等[25]報(bào)道，齊墩果酸和熊果酸都有穩(wěn)定脂質(zhì)體膜的作用，同時(shí)證明女貞子水提物有改善氧化還原穩(wěn)態(tài)的作用，機(jī)理是通過(guò)增加血清總抗氧化能力來(lái)降低MDA 和8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷。本試驗(yàn)中，添加女貞子改善了血液抗氧化功能，提高了SOD 水平，降低了MDA 水平，表明添加女貞子可提高羔羊抗氧化性能。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)用代乳粉的營(yíng)養(yǎng)成分與母羊的自然乳基本一致，可以有效降低羔羊真胃臌氣的發(fā)病率；添加女貞子粉的代乳粉可以降低腹瀉的發(fā)生率，還可以降低促炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-8，通過(guò)提高IgG 水平改善羔羊主動(dòng)免疫功能，并且可以通過(guò)降低可的松和PGE2水平來(lái)緩解應(yīng)激；同時(shí)通過(guò)提高SOD 和降低MDA 的方式來(lái)改善抗氧化狀態(tài)。