張家才，熊銘鑫，張 聰，齊德生

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

雞蛋殼是一種生物陶瓷性材料，主要由95% 的碳酸鈣和3.5%的基質(zhì)蛋白組成[1]。蛋殼在子宮中鈣化形成，持續(xù)約18 h，大致分為3 個關(guān)鍵性的階段：鈣化啟動階段（排卵后6～8 h）、線性沉積階段（排卵后14～16 h）和鈣化末期（排卵后20～22 h）[2]。超微結(jié)構(gòu)研究表明，蛋殼可分為雙層殼膜、乳突層、柵欄層、垂直晶體層和角質(zhì)層[3]。在蛋雞行業(yè)，每年在雞蛋收集、存儲和運輸過程中因破蛋而造成的經(jīng)濟損失較大。我國蛋雞養(yǎng)殖場雞蛋破損率為10.5%[4]。早期研究表明外源孕酮可以影響蛋殼鈣化。如Nys 等[5]在蛋雞排卵后4 h注射劑量為1 mg/kg 體重（BW）孕酮，蛋殼重顯著增加，這表明孕酮促進(jìn)了蛋殼鈣化。但Lundholm 等[6]給蛋雞口服40 mg/kg BW 孕酮拮抗劑RU38486，使蛋殼厚度增加了12.1%，表明孕酮可能抑制蛋殼鈣化。最近的相關(guān)研究中，Liu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，注射孕酮的蛋雞產(chǎn)高蛋殼強度蛋的概率大于對照組。相關(guān)研究并不能解釋這種似乎矛盾的現(xiàn)象。

在一個產(chǎn)蛋循環(huán)中，血液孕酮含量在排卵前的4～6 h達(dá)到最高[8]，促進(jìn)卵巢排卵，此時子宮中的蛋殼鈣化處于鈣化末期，且未有研究表明此孕酮峰值與蛋殼鈣化有關(guān)。除了孕酮峰值，血液孕酮在排卵后1～5 h 的含量也高于其他鈣化時期的基礎(chǔ)水平[9]。因此，本研究提出假設(shè)孕酮在排卵后1～5 h 可能影響蛋殼鈣化。為了驗證這一假設(shè)，本研究用不同劑量的孕酮在排卵后的1～5 h 注射蛋雞，檢測蛋殼品質(zhì)，探究孕酮對蛋殼品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 挑選蛋殼強度在25～35 N 的40 周齡海蘭褐蛋雞72 只，隨機分為6 組，每組12 只雞，單籠飼養(yǎng)。自由采食和飲水。日糧原料組分和營養(yǎng)成分見表1。每天05:00—17:00 觀察每只蛋雞的產(chǎn)蛋時間并記錄，連續(xù)觀察10 d，用于推測準(zhǔn)確的排卵時間（產(chǎn)蛋后約30 min內(nèi)排卵）。根據(jù)推測的排卵時間，分別于排卵后1、2、5 h 腿肌注射不同劑量的孕酮：排卵后5 h，孕酮注射劑量分別為0.00（對照）、1.00（處理1）、0.25 mg/kg BW（處理2）；排卵后2 h，孕酮注射劑量分別為0.25（處理3）、0.15 mg/kg BW（處理4）；排卵后1 h，孕酮注射劑量為0.15 mg/kg BW（處理5）。試驗用孕酮標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 公司，用花生油溶解配制使用。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 蛋殼強度與厚度 孕酮處理后第2 天上午收集各組所產(chǎn)雞蛋。各組隨機挑選8 個雞蛋用于檢測蛋殼品質(zhì)。用蛋殼強度測定儀（EFG-0503，日本）檢測蛋殼強度。檢測時雞蛋尖端朝下，鈍端朝上。用螺旋測微器分別測定蛋殼尖端、鈍端和赤道區(qū)域的厚度，計算出平均值作為蛋殼厚度。

表1 日糧原料組分及營養(yǎng)成分

1.2.2 蛋殼超微結(jié)構(gòu) 用掃描電子顯微鏡（JSM-6390LV，日本）掃描蛋殼橫斷面的超微結(jié)構(gòu)。手動打破雞蛋，用蒸餾水洗凈內(nèi)表面殘留的蛋清和外表面的污垢。按Kaplan 等[10]報道的方法去除殼膜。室溫下干燥后，取雞蛋赤道區(qū)域約1 mm2的長方形蛋殼碎片，橫斷面朝上固定于粘貼板上。噴金后用于觀察蛋殼超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計分析 用SPSS 20.0 統(tǒng)計并分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并用Duncan′s 法分析組間的差異顯著性，以P＜0.05 為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕酮對蛋殼強度的影響 由圖1 可知，處理1 均產(chǎn)破殼雞蛋，處理2 產(chǎn)部分破殼和部分蛋殼完好的雞蛋，因此處理1 和處理2 的蛋殼強度無法測定。處理1 和處理2 中，孕酮抑制了蛋殼鈣化，且蛋殼表面發(fā)白。表2數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，處理1 和處理2 的蛋殼厚度顯著降低；處理3 和處理5 蛋殼強度和厚度無顯著變化；處理4 的蛋殼強度和蛋殼厚度顯著增加。結(jié)果表明，孕酮對蛋殼品質(zhì)的影響與注射時間和劑量均密切相關(guān)。

2.2 孕酮對蛋殼超微結(jié)構(gòu)的影響 處理1 和處理4 的雞蛋表觀差異最為顯著，更能顯示孕酮對蛋殼的影響，故選擇對照組、處理1 和處理4 的雞蛋殼進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析。由圖2 和表3 可見，與對照組相比，處理1 的有效層厚度顯著降低，乳突層和乳突小體寬無顯著變化；處理4 的有效層厚度顯著增加，乳突層厚度和乳突小體寬均顯著降低。結(jié)果表明，孕酮通過改變蛋殼的超微結(jié)構(gòu)而影響蛋殼品質(zhì)。

3 討 論

表3 孕酮注射對蛋殼超微結(jié)構(gòu)的影響 μm

從排卵到形成雞蛋產(chǎn)出需要24～25 h。排卵后約6 h雞蛋進(jìn)入子宮，開始鈣化。在這一循環(huán)內(nèi)，血液孕酮含量呈規(guī)律性波動[11]。關(guān)于孕酮對雞蛋殼品質(zhì)影響的報道較少。趙海旋[12]報道，在蛋進(jìn)入子宮45 min 和15 h時，注射1 mg/kg BW 孕酮會使蛋殼厚度極顯著增加；而子宮部鈣結(jié)合蛋白（CaBP-D28k）、鈣離子ATP 酶（Ca2+-ATPase）和碳酸酐酶（CA）基因的表達(dá)量均顯著降低。葉幼榮[13]研究結(jié)果表明，蛋殼鈣化時，孕酮抑制了子宮的Ca2+轉(zhuǎn)運和CaCO3的形成。這在細(xì)胞試驗上也得到了驗證。Bar[14]在蛋雞產(chǎn)蛋后2～3 h 注射1 mg/kg BW 孕酮，Ca2+轉(zhuǎn)運效率和CaBP-D28k 的mRNA 水平顯著降低。這與趙海旋[12]研究結(jié)果一致，表明孕酮可以抑制子宮Ca2+轉(zhuǎn)運而影響蛋殼形成。但這不能解釋趙海旋[12]研究中蛋殼厚度極顯著增加的現(xiàn)象。

蛋殼品質(zhì)與其超微結(jié)構(gòu)有關(guān)[15]。乳突層越小、乳突小體寬越小和有效層厚度越大，蛋殼強度越大[16]。超微結(jié)構(gòu)主要由基質(zhì)蛋白調(diào)節(jié)，如OC-116、OC-17 蛋白等[17-18]。蛋殼鈣化時，OC-17 結(jié)合無定型CaCO3，形成晶體沉積到蛋殼表面[19]。而CaCO3晶體的形態(tài)和沉積方向受卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（OVO）和卵清蛋白（OVA）調(diào)節(jié)[2]。本研究中，處理1 和處理4 蛋殼超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化，表明孕酮可能通過影響蛋殼乳突層結(jié)構(gòu)和有效層厚度來改變蛋殼品質(zhì)。乳突層結(jié)構(gòu)與基質(zhì)蛋白OCX-32 有關(guān)[20]。孕酮是否可以調(diào)節(jié)OCX-32基因的表達(dá)，還需進(jìn)一步研究。

本研究在排卵后1～5 h 分別給蛋雞注射不同劑量孕酮，處理1 和處理2 蛋殼品質(zhì)顯著降低，處理3 和處理5 蛋殼品質(zhì)無顯著變化，處理4 蛋殼品質(zhì)顯著增加，表明孕酮對蛋殼鈣化的影響與注射時間和劑量有關(guān)。這可以解釋早期相關(guān)研究結(jié)果中的不一致。Wells[21]研究表明，孕酮在體內(nèi)代謝較快，半周期為16～18 min。孕酮促進(jìn)可調(diào)節(jié)蛋殼超微結(jié)構(gòu)的蛋白OVA和OC-17基因表達(dá)[13]。結(jié)合本試驗結(jié)果和已有的研究報道，推測孕酮對蛋殼鈣化的影響可能存在2 種機制：①孕酮既抑制子宮的Ca2+轉(zhuǎn)運和CaCO3的形成，同時也促進(jìn)了可以調(diào)節(jié)蛋殼超微結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)蛋白（OVA、OC-17）的表達(dá)。在接近蛋殼鈣化啟動時，注射劑量較高的孕酮使血液孕酮在鈣化啟動時含量任然較高，抑制子宮內(nèi)CaCO3的形成，導(dǎo)致鈣化無法正常進(jìn)行（處理1、2）。與之相反，在遠(yuǎn)離鈣化啟動時，注射低劑量孕酮，使血液孕酮在鈣化啟動時回復(fù)正常，CaCO3正常形成，又由于孕酮促進(jìn)了調(diào)節(jié)蛋白（OVA、OC-17）的表達(dá)，形成的蛋殼結(jié)構(gòu)更加致密，蛋殼強度增加（處理4）。②孕酮可能改變殼膜的成分或結(jié)構(gòu)，改變殼膜上的CaCO3晶體的成核位點而影響鈣化初期乳突層的形成。殼膜在排卵后3～4 h 形成，其結(jié)構(gòu)與成分也影響蛋殼強度[22]。殼膜上的成核位點影響蛋殼乳突層結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，孕酮可以影響蛋殼強度、蛋殼厚度和蛋殼超微結(jié)構(gòu)，對蛋殼品質(zhì)有抑制和促進(jìn)雙重調(diào)控作用，其影響與劑量和注射時間有密切關(guān)系。這表明孕酮對蛋殼調(diào)控可能存在2 種機制。