張立春 ，李夢姝，，張珈溯，云巾宴，柳儉強，曹 陽，金海國，夏廣軍*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧分院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 130021；3.長春金賽藥業(yè)股份有限公司，吉林長春 130012)

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）屬I 型分泌性糖蛋白，分子量在34～45 KD 之間，其主要生理功能包括促進血管內(nèi)皮細胞增殖、增強血管通透性、改變細胞外基質(zhì)及誘導血管生成等[1]。目前發(fā)現(xiàn)的人VEGF 家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盤生長因子（Placenta growth factor，PGF）[2]。VEGF-B 氨基酸組成及空間結(jié)構(gòu)與VEGF-A 相似，又被稱為VEGF 相關(guān)因子[3]。人VEGF-B基因含有6 個外顯子，其中外顯子6 可發(fā)生可變剪切生成2 種變異體VEGF-B167 和186[3]。人和小鼠VEGF-B基因具有廣譜的組織分布特性[4-5]，但在小鼠心臟、骨骼肌中高表達[4]，人中除心臟和骨骼肌外，還在脂肪組織及血管中高表達[5]，提示物種間VEGF-B 的差異性。由此推測VEGF-B基因在心臟血管發(fā)育及誘導心肌肥大等方面發(fā)揮作用[6]。另外與VEGF 家族其他成員所不同的是VEGF-B 并不表現(xiàn)出明顯的腫瘤促進功能，而表現(xiàn)在能量代謝、神經(jīng)保護方面，進一步提示VEGF 家族成員功能的差異性[7]。

VEGF-B基因可在皮膚組織中表達，但在EGF 和TGF-β1 刺激情況下，皮膚成纖維細胞中VEGF-B 敏感性要高于膠質(zhì)細胞[8]。皮膚成纖維細胞中盡管VEGF-B缺失并不影響受損皮膚組織血管修復[9]，但通過轉(zhuǎn)基因方法表達VEGF-B 卻可加快皮膚組織血管恢復[10]。目前除VEGF-A 外，其他VEGF 家族成員并未有直接證據(jù)證明參與毛囊毛發(fā)發(fā)育[11]。課題組前期研究證明新吉細毛羊在毛用性狀相關(guān)指標上顯著優(yōu)于小尾寒羊，其潛在影響因素在于皮膚毛囊組織功能差異[12]。進一步在綿羊皮膚組織中相繼克隆出VEGF 家族A、C、D和PGF基因[13-16]，并揭示不同家族成員在皮膚組織中通過可變剪切（Alternative Splicing,AS）產(chǎn)生多種類型轉(zhuǎn)錄本[13-15]。本文進一步以小尾寒羊與新吉細毛羊為研究對象，克隆綿羊VEGF-B基因并進行系統(tǒng)分析，為系統(tǒng)了解綿羊VEGF 基因家族在皮膚組織中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RNAlater 購置于QIAGEN 公司、Trizol購自于Invitrogen 公司；pMD18-T 載體、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit 和Ex Taq 酶均購自大連Ta KaRa 公司；大腸桿菌工程菌DH5α為本實驗室保存。

1.2 實驗樣品采集 本實驗動物為前期研究相同實驗群體與實驗樣品[11]。

1.3 引物設(shè)計與合成 由于目前GenBank 數(shù)據(jù)庫中尚未有綿羊VEGF-B基因mRNA 數(shù)據(jù)信息，僅有預測的cDNA 序列，本實驗以預測序列為模板，設(shè)計引物，引物序列參見表1。引物合成委托北京華大基因生物公司完成。

表1 引物序列及擴增條件

1.4 皮膚總RNA 提取與cDNA 一鏈合成 皮膚總RNA提取采用液氮研磨，Trizol 法提取。瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測后-80℃保存?zhèn)溆谩DNA 第一鏈合成反應(yīng)參照PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，具體步驟按說明書進行。

1.5 RT-PCR 與基因克隆 RT-PCR 擴增體系為25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.5μL，sVEGF-B_C 上 下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，0.5 U/μL Taq 酶0.2 μL，cDNA 模 板1 μL，ddH2O 17.8μL。反應(yīng)條件為94℃預變性2 min，擴增程序為94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共35 個循環(huán)，最后72℃ 5 min 延伸。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收和T 載體連接等后續(xù)實驗，陽性菌落送生物公司完成測序反應(yīng)，測序結(jié)果進行生物信息學分析。

1.6 生物信息學分析 測序結(jié)果首先用DNASTAR7.0軟件包Seqmen 進行序列拼接，拼接序列利用Blast N在GenBank 數(shù)據(jù)庫進行序列比對。核酸及氨基酸多序列比對采用DNAman 9.0 軟件進行。可變剪切分析主要將所獲得的序列與綿羊基因組數(shù)據(jù)比對，并參照比對結(jié)果繪制可變剪切模式圖。蛋白序列功能結(jié)構(gòu)域分析采用SMART 在線數(shù)據(jù)庫分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）。蛋白氨基酸序列酶切位點分析采用PeptideCutter進行（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）。

1.7 不同組織器官VEGF-B 可變剪切體分布與表達分析 不同組織器官VEGF-B 可變剪切體分布檢驗通過設(shè)計不同可變剪切體檢測引物（表1），以不同綿羊組織器官cDNA 為模板，采用RT-PCR 方法檢驗不同組織器官中可變剪切體是否存在特異性分布情況。不同組織器官表達譜分析則在保守區(qū)設(shè)計qRT-PCR 引物（表1），采用羅氏light cycle 480 II 機器進行。反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 8.6 μL，cDNA 模 板1μL，Light cycler 480 SYBR Green I master 10 μL，正、反向引物各0.2 μL。PCR 反應(yīng) 條 件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，擴增反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析。每個品種檢測2 個個體，每個樣品重復進行3 次。以GAPDH 引物為內(nèi)參，檢測結(jié)果利用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析并繪制柱形圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 綿羊VEGF-B基因克隆與序列分析 以小尾寒羊與新吉細毛羊皮膚組織cDNA 為模板，經(jīng)RT-PCR 擴增，電泳檢測顯示成功擴增出目的條帶，但不同個體間存在大小差異（圖1）。考慮到VEGF-B基因可能存在可變剪切，將擴增電泳條帶全部回收、克隆測序分析，Blast N 比對結(jié)果顯示所回收的擴增片段均為VEGF-B基因，與參考序列同源性均在98% 以上。所獲得的擴增片段大小依次為978 bp 和877 bp，分別命名為X-B4、X-B7 和S-C1。其中X-B4 與參考序列（序列號：XM_012117071.2）相同，為VEGF-B基因預測突變體X2。X-B7 和S-C1 片段中間區(qū)出現(xiàn)101 bp 的片段缺失（圖2），與VEGF-B基因預測突變體X3 序列相同（序列號：XM_012117072.2）。

進一步序列分析發(fā)現(xiàn)，本實驗所克隆到的VEGF-B基因并不包含完整的ORF 框，氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)本實驗所獲得的2 種類型VEGF-B基因編碼蛋白C 端氨基酸序列差異較大，從本質(zhì)上說已完全不屬于同一蛋白（圖3），但Blast P 結(jié)果發(fā)現(xiàn)X-B4 編碼氨基酸序列除與突變體X2 相同外，還與牛VEGF-B186 高度同源。X-B7 和S-C1 所編碼氨基酸序列除與突變體X3 相同外，也與牛VEGF-B基因氨基酸序列高度同源，一方面說明牛羊之間VEGF-B基因親緣關(guān)系較近，另一方面也說明本實驗所克隆到的VEGF-B基因2 種類型可變剪切模式具有物種間的普遍性[17]。SMART 分析結(jié)果顯示2 種類型氨基酸序列突變均未造成PDGF 功能結(jié)構(gòu)域的改變，影響的僅是蛋白C 末端長度及結(jié)構(gòu)性改變，推測可能并不能從根本上改變VEGF-B 功能，目前尚不清楚綿羊VEGF-B不同突變類型的功能及產(chǎn)生機制。

VEGF 家族蛋白成熟過程需要經(jīng)歷N 端及C 端前導肽的蛋白水解過程。本實驗中所發(fā)現(xiàn)的2 種類型VEGF-B 蛋白C 末端氨基酸差異性是否影響蛋白水解，利用PeptideCutter 在線分析程序?qū)-B4 和X-B7部分氨基酸序列進行蛋白酶位點預測發(fā)現(xiàn)，2 種類型VEGF-B 氨基酸序列蛋白酶預測位點存在明顯變化（圖4、表2），其中X-B4 氨基酸序列中Proteinase K和Thermolysin 酶切位點數(shù)量明顯增加，X-B7 氨基酸序列中Arg-C proteinase、Clostripain、NTCB（2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid）和Trypsin 酶切位點數(shù)量明顯增加，提示2 種類型VEGF-B 蛋白在水解加工過程中可能存在差異。

表2 X-B4 與X-B7 氨基酸C 末端段蛋白酶切位點預測結(jié)果

2.2 不同組織器官VEGF-B基因可變剪接體突變體表達模式分析 鑒于在綿羊皮膚組織中所克隆到的VEGF-B基因存在2 種類型的可變剪切突變體，為探討該突變體是否具有組織特異性，本實驗設(shè)計可變剪切體檢測引物，以小尾寒羊心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、腸道、肌肉、卵巢和腦組織cDNA 為模板，通過RT-PCR 法檢測不同器官的VEGF-B基因的可變剪切類型（圖5）。結(jié)果顯示在小尾寒羊個體各個組織中均有表達，片段大小與預測相同，但在腸道組織、卵巢及皮膚組織中還擴增出一條150 bp 左右的特異性條帶，目前尚不清楚該條帶是非特異性擴增還是該組織中存在其他不同類型的突變體mRNA（圖5）。同時值得注意的是在心臟組織中出現(xiàn)一條較為特異的擴增條帶，較877 bp 檢測片段稍小，考慮到PCR 擴增反應(yīng)特異性較強，且其他組織中并未發(fā)現(xiàn)類似擴增產(chǎn)物，推測腸道、卵巢和皮膚以及心臟組織VEGF-B基因可能存在組織特異性的可變剪切方式。

2.3 不同組織器官VEGF-B基因表達譜分析VEGF-B基因不同AS 類型在組織器官特異性檢測發(fā)現(xiàn)僅存在輕微差異，為進一步檢驗該基因在不同組織器官中的表達差異，本實驗選取2 頭成年小尾寒羊個體，利用qRTPCR 法檢驗心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腸、肌肉、卵巢和腦組織中的相對表達水平，并以心臟組織為參照，繪制VEGF-B基因在不同組織器官中的相對表達量柱形圖（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-B在不同組織器官中的表達量變異較大，其中脾臟和腎臟相對心臟表達量略高，大約為心臟表達水平的1.5 倍。肺臟與卵巢組織中則明顯高于心臟組織，相對表達量依次為5.3 倍和2.3 倍。與上述組織相反，腸道、肝臟、肌肉和腦組織中VEGF-B基因表達量較心臟組織表達量下調(diào)，其中肝臟組織和腦組織相對表達量僅為心臟組織的20%左右，肌肉則更低，相對表達量僅為8%。腸道組織相對表達降低則不如上述器官明顯，約為心臟組織表達水平的60%。

3 討 論

小尾寒羊是我國特有的地方綿羊品種，具有高繁殖率、耐粗飼的優(yōu)良特性，但其產(chǎn)肉、產(chǎn)毛性能低下，毛多以粗毛和兩型毛為主，盡管經(jīng)過一定的選育提高，但仍主要用于毛氈、毛毯等生產(chǎn)為主，無法用于高檔毛紡面料[18]。新吉細毛羊是本世紀初我國新疆和吉林兩省育種學家以澳洲美利奴羊毛為父本，以地方細毛羊為母本培育出的細毛羊品種，具有毛用性狀優(yōu)良、遺傳潛力大等突出優(yōu)點[19]。小尾寒羊與新吉細毛羊同時可作為綿羊毛品質(zhì)遺傳機制研究的理想動物模型，用以挖掘影響毛用性狀的功能基因。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊皮膚毛囊組織結(jié)構(gòu)存在顯著差異，差異之一為毛細血管密度差異，進一步分析發(fā)現(xiàn)VEGF 家族基因在綿羊皮膚中均有表達，且存在類型多樣的可變剪切突變體。鑒于皮膚組織脈管結(jié)構(gòu)分布豐富，毛囊生長發(fā)育與周期過程中同樣伴隨著周圍毛細血管的新生與退化過程[20]，VEGF 可能作為重要的血管增殖調(diào)控因子直接參與毛囊周圍血管新生與退化，間接調(diào)控毛囊及毛發(fā)生長發(fā)育過程[21]。本文克隆出綿羊VEGF-B基因mRNA 并對其進行了系統(tǒng)的生物學分析，為進一步研究綿羊VEGF-B基因功能奠定基礎(chǔ)。

目前基因數(shù)據(jù)庫中尚未有綿羊VEGF-B基因mRNA序列信息的報道，本實驗利用預測序列設(shè)計引物在小尾寒羊與新吉細毛羊皮膚組織擴增長短不同的2 條片段VEGF-B基因mRNA 序列，分別與預測序列XM_0121 17071.2 和XM_012117072.2 相同，但并未發(fā)現(xiàn)與另一種類型突變體所對應(yīng)的片段（序列：XM_012117073.2），提示VEGF-B基因在綿羊皮膚組織中表達具有自身特點。值得注意的是mRNA 中間部分缺失導致所編碼蛋白產(chǎn)生移碼突變，這種類似突變在不同物種間普遍存在[17]，其原因在于這種突變類型并未改變PDGF 功能結(jié)構(gòu)域，PDGF 功能結(jié)構(gòu)域是VEGF 家族的功能核心，其左右兩端序列會在蛋白加工成熟過程中由蛋白酶水解去除[22]。2 種類型VEGF-B 蛋白C 端蛋白酶切位點預測結(jié)果證實存在蛋白酶類型及數(shù)量差異，進而可能影響VEGF-B 的加工過程及功能活性。

為探尋VEGF-B不同類型可變剪切體組織器官的表達特性，對10 個組織器官檢測發(fā)現(xiàn)VEGF-B不同類型可變剪切體具有組成型表達的特性，但也可能存在組織器官間的細微差別，該基因與傳統(tǒng)可變剪切具有組織器官特異性的特點存在一定差異[23-24]，說明2 種類型可變剪切體具有普遍性，也提示氨基酸序列突變及潛在蛋白酶解加工過程同樣具有普遍意義。實驗室研究結(jié)果表明，在皮膚組織中除VEGF-D基因不存在可變剪切突變體外，VEGF-C[25]、B、A[13]和PGF[15]均存在不同類型的可變剪切突變體，進一步證明VEGF 基因的復雜性[26]。

對不同組織器官VEGF-BmRNA 表達檢測結(jié)果顯示，在肺臟和卵巢組織較心臟呈現(xiàn)高表達，脾臟和腎臟基本持平，肝臟、腸道、肌肉和腦組織較心臟下調(diào)表達，該結(jié)果與人VEGF-B表達模式部分相似[5,27]，似乎與組織器官血管密度不存在直接相關(guān)性。但考慮到VEGF-B功能主要參與血管內(nèi)皮細胞增殖、血管通透性增強、細胞外基質(zhì)改變及誘導新生血管生成等，可能在成年綿羊個體中VEGF-B 主要功能是維持血管通透性，如肺臟組織，而在發(fā)育完全且血管不太可能增生的組織器官如肌肉、腦等，其表達量維持較低的水平。但由于未對特定可變剪切類型進行進一步表達分析，不同類型是否在特定組織器官表現(xiàn)累積特性尚不得而知，這也是下一步研究的重點。

皮膚組織結(jié)構(gòu)與功能復雜，既為機體與外界環(huán)境的第一道屏障，擔負機體免受外界物理、化學及生物損傷等重要功能，同時也是指甲、毛發(fā)等皮膚附屬物的發(fā)生組織。本實驗室證實小尾寒羊與新吉細毛羊在皮膚組織結(jié)構(gòu)及毛用性狀相關(guān)指標存在顯著差異。人皮膚組織中同樣表達VEGF 家族基因，但在皮膚角質(zhì)細胞和成纖維細胞中，對生長因子刺激，VEGF-B基因僅僅在皮膚成纖維細胞中呈現(xiàn)出上調(diào)表達，提示VEGF 家族更多參與皮膚組織修復等生理病理過程[28]，該結(jié)果與上皮細胞特異性轉(zhuǎn)VEGF-B基因小鼠實驗結(jié)果相似[10]。有研究表明，生長期毛囊中VEGFmRNA 表達上調(diào)[11]，轉(zhuǎn)VEGF 基因亦能誘導毛囊周圍血管的形成[29]，VEGF 促毛囊生長作用多指VEGF-A[30]，目前尚無其他家族成員與毛囊生長發(fā)育的相關(guān)研究報道，VEGF-B在皮膚組織表達分布及具體生物學功能值得關(guān)注。

4 結(jié) 論

本研究通過RT-PCR 方法從不同品種綿羊皮膚組織中成功地克隆出VEGF-B基因片段，序列分析發(fā)現(xiàn)VEGF-B片段由不同可變剪切方式生成并導致RNA 所編碼蛋白序列移碼突變，所編碼的VEGF-B突變體具有物種間保守型。主要引起VEGF-B 突變體PDGF 結(jié)構(gòu)域C 端蛋白酶切位點的改變。表達分析顯示2 種類型VEGF-B突變體具有組成型表達特性，相對心臟組織、肺臟和卵巢組織呈現(xiàn)高表達，肝臟、腸道和腦組織中低表達。本實驗為研究VEGF-B基因功能提供基礎(chǔ)。