康 景，封 洋

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅蘭州 730070）

褪黑激素（MT）是由Lerner 在牛松果體中分離和鑒定出來的一種吲哚類激素[1]，是影響毛皮動物絨毛生長發(fā)育的重要因素。目前，MT 在畜禽中的研究應用主要集中在調(diào)控生殖、提高免疫及誘導毛皮動物毛囊發(fā)育等方面[2]，尤其在促進狐、水貂等貴重毛皮動物毛囊發(fā)育和皮張?zhí)崆俺墒旆矫婢哂兄匾饔?。德吉等[3]曾報道，外源性MT 能夠提高藏西北絨山羊血清中的MT 濃度，并顯著提高其絨毛的纖維長度及生長速度。何茂昌等[4]也證實了外源性MT 可激活次級毛囊，使隴東絨山羊的毛囊活率顯著提升。但由于MT 能抑制動物的生殖活動[5]，因此在生產(chǎn)中只應用于商品類畜禽，而不予在種畜上使用，這在一定程度上降低了經(jīng)濟效益。郭雪峰等[6]研究表明哺乳動物毛囊的發(fā)生始于胚胎期，而劉憲明[7]認為影響動物毛囊發(fā)育的主要因素是遺傳。諸多研究均證實毛囊密度在哺乳動物胎兒時期就已成型，出生后依靠外界條件加以改善的可能性較小，且本實驗前期研究也證實了獺兔母體埋植MT 后可促進子代兔的毛囊發(fā)育（尚未發(fā)表）。因此，除選種選育外，從胎兒時期改變毛皮動物的毛囊密度是目前研究的主要方向。

RORα（Retinoid Avid Receptor Related Orphan Receptor a，RORα）基因是維甲酸相關孤核受體亞家族成員之一，同時也作為MT 的受體對促進毛皮動物絨毛生長及毛囊發(fā)育起到重要作用[8]。段春輝等[9]在探究MT 調(diào)控山羊絨生長的模式及機理的過程中發(fā)現(xiàn)，外源性MT 可通過提高內(nèi)源性MT 的濃度使RORα基因表達量上升，從而促進絨山羊產(chǎn)絨。吳靜等[10]也發(fā)現(xiàn)MT可與毛囊及毛乳頭中的RORα基因結(jié)合，達到調(diào)控毛囊周期性生長的目的。

近年來，學者們在絨山羊、大鼠、水貂等多種毛皮動物自身探究了外源性MT 促進絨毛生長的分子機理，但關于母體埋植MT 對子代動物內(nèi)臟組織中RORα基因表達的影響尚未見相關報道。本實驗在獺兔母體皮下埋植MT，探討RORα基因在子一代兔內(nèi)臟組織中的表達規(guī)律和MT 對此規(guī)律的影響，為進一步研究MT 與動物產(chǎn)絨性能之間的關系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗選擇相近月齡健康母獺兔110 只，獺兔來自甘肅省遠發(fā)牧業(yè)有限公司獺兔場。

1.1.2 主要儀器 震蕩儀（德杜精密儀器有限責任公司，中國江蘇）、PCR 擴增儀（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國北京）、微量移液槍（上海艾測電子科技有限公司，美國）、電泳儀、離心機（北京時代北利離心機有限公司，中國北京）、微量離心管、恒溫水浴鍋、紫外透射儀。

1.1.3 主要試劑 核酶、引物、轉(zhuǎn)錄酶、Tap 聚合酶、dNTP、瓊脂糖、緩沖液、滅菌水。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計 選擇110 只相近月齡的健康母獺兔同日配種，第5 日后選出已確定妊娠的母兔76 只，隨機平均分為2 組，對照組母兔不做處理；試驗組母兔埋植10 mg MT。仔兔在出生第1 天時，每組選15 只宰殺，取皮膚、肌肉、肺臟、心臟、肝臟、腎臟及十二指腸組織樣品，測定仔兔組織樣品中RORα基因的表達量。

1.2.2 引物信息表 引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.3 RNA 提取及cDNA 合成 參照TaKaRa 試劑盒說明進行RNA 的提取和cDNA 的合成。

1.2.4 Real Time PCR 擴增 以總RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為模板，在熒光定量PCR 儀上進行實時熒光定量PCR 擴增。檢測反應液中TB Green 的熒光強度，從而監(jiān)控PCR 產(chǎn)物的擴增量?？傮w系20 μL：TB Green Premix Ex Taq II 10 μL；DNA 模板2 μL；滅菌水6.4 μL；上、下游引物各0.8 μL。PCR 反應程序：95℃預變性30 s，1 個循環(huán)；95℃定量分析5 s；熔解曲線：95℃延伸5 s；60℃延伸1min 以終止反應，1 個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 21.0 軟件分析2 組仔兔同一指標間RORα基因表達的差異性，所得數(shù)據(jù)均以“平均值± 標準誤”表示，P＜0.05 表示差異顯著；P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1RORα基因PCR 產(chǎn)物檢測 由圖1 可知，以總RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA 為模板，來檢測PCR 引物的質(zhì)量及PCR 最優(yōu)條件。利用基因上、下游引物進行Real Time PCR 反應，反應所得電泳片段值與預期一致，說明基因引物擴增特異性良好，可用于熒光定量實驗。

2.2 實時熒光定量PCR 擴增曲線 由圖2 可知，擴增曲線呈“S”型，可明顯區(qū)分平臺期與指數(shù)期，這是由于隨著擴增規(guī)模增大，各種要素逐漸被飽和，而產(chǎn)物增長速度逐漸減緩所致。

2.3 實時熒光定量PCR 熔解曲線 由圖3 可知，RORα基因的熔解曲線為單峰，說明產(chǎn)物擴增效果良好，且擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號均為特異性產(chǎn)物的熒光信號，無引物二聚體或非特異性擴增產(chǎn)生。

2.4RORα基因在不同組織中的表達量 由圖4 可知，與對照組相比，RORα基因在試驗組仔兔的皮膚組織中呈極顯著上調(diào)趨勢，在肌肉、肺臟組織中均呈顯著上調(diào)趨勢；在仔兔肝臟組織中呈極顯著下調(diào)趨勢，在心臟、腎臟組織中呈顯著下調(diào)趨勢；十二指腸中則表達不顯著。

3 討 論

3.1 母體埋植MT 對仔兔皮膚、肌肉、肺臟組織中RORα基因的影響 大量研究表明RORα基因在動物大腦、皮膚、胸腺、睪丸、子宮等器官中均有表達[11]，如Pozo 等[12]研究指出RORα基因在動物皮膚組織中表達量最高。常子麗等[13]研究發(fā)現(xiàn)隨著自然光照時間的延長，RORα基因在內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚組織中的表達量也逐漸提高，故推測其與光周期的變化有關。趙艷紅等[13]也證實了RORα基因在各月份絨山羊皮膚組織中均有表達，且不同月份之間的表達量存在一定差異，其中8 月長日照時期RORα基因表達量顯著低于2 月的表達量，故推測該基因的表達可能與MT 水平的變化有關。張紫奇等[14]證實了在埋植MT 后RORα基因的表達量在內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚組織中呈顯著上調(diào)趨勢，這是由于RORα基因是MT 的受體，而毛囊是一種皮膚器官，因此該基因可能在皮膚組織中高表達[15]。本研究中，試驗組仔兔皮膚組織中RORα基因的表達量極顯著高于對照組，故推測MT 能通過母體埋植而提高RORα基因在子代兔皮膚組織中的表達量，由此達到改善子代兔毛囊發(fā)育的目的（本實驗前期研究也已證實此結(jié)論），其原因可能是RORα基因參與了調(diào)節(jié)。

有研究表明，RORα基因在動物骨骼肌細胞和肌原細胞中也有表達。王康等[16]在檢測外源性MT 在長毛兔肌肉組織中的殘留量時，發(fā)現(xiàn)埋植過MT 的水貂和銀霜狐肌肉組織中MT 含量高出對照組數(shù)十倍，原因是由于實驗動物采用電擊致死，血液大部分保留在胴體中，因此胴體中MT 含量較高。唐政[17]等研究發(fā)現(xiàn)，埋植MT 后，藍狐和水貂肌肉組織中MT 含量均顯著升高，故推測其受體RORα基因也可能在動物肌肉組織中高表達，這是由于MT 可上調(diào)MyoD 和p300 的表達誘導肌蛋白合成、促進骨骼肌細胞分化、維持肌細胞正常形態(tài)及生理功能。本研究結(jié)果顯示，獺兔母體埋植MT 后，仔兔肌肉組織中MT 含量升高，其受體RORα基因的表達量與對照組相比也顯著上調(diào)，說明外源性MT 可通過母體使其受體基因RORα在子一代獺兔肌肉組織中高表達。

由于RORα基因在動物肺臟組織中的表達尚未見相關報道，故此部位主要探討ROR 家族中的另一相關基因——維甲酸相關核孤兒受體-γt基因的表達。王曉群等[18]在研究甲苯二異氰酸酯致哮喘的過程中發(fā)現(xiàn)ROR-γt基因在哮喘組小鼠肺部中的表達水平極顯著高于對照組，這是由于小鼠體內(nèi)Th17 細胞免疫失衡所致，而ROR-γt基因是Th17 細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，因此阻斷ROR-γt基因表達可在一定程度上抑制Th17 細胞分化，從而達到減輕哮喘炎性反應的目的[19]。卞芳芳等[20]在探討布地奈德治療哮喘小鼠的機制時發(fā)現(xiàn)ROR-γt基因及IL-17 水平在哮喘小鼠肺組織中高表達，而BUD治療組小鼠肺組織中的ROR-γt基因及IL-17 表達水平均顯著低于哮喘組，因此，卞芳芳等認為BUD 可阻斷該基因在肺部的表達并抑制IL-17 細胞的分泌，從而減輕哮喘炎性反應。故推測同為MT 受體的RORα基因也可能致哮喘，二者在動物肺臟組織中的表達可互作參考。本研究結(jié)果則顯示，獺兔母體埋植MT 后，RORα基因在仔兔肺臟組織中的表達水平與對照組相比呈顯著升高，說明外源性MT 可通過母體使其受體基因RORα在子一代兔肺臟中高表達，從而達到抑制Th17 細胞分化、減輕動物疾病發(fā)生的目的。

3.2 母體埋植MT 對仔兔肝臟、心臟、腎臟組織中RORα基因的影響 戚朝霞等[21]在探討RORα基因在慢性乙型肝炎發(fā)病機制中的作用時發(fā)現(xiàn)，該基因及Th17 細胞水平在慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的表達水平顯著高于對照組，這是由于RORα基因能夠促進Th17 細胞的分化，從而誘發(fā)慢性乙型肝炎、慢性加急重型乙肝及原發(fā)性肝癌等疾病。RORα基因在動物心臟、腎臟組織中的表達雖未見相關報道，但對于同樣作為褪黑激素受體的ROR-γt基因，顏玉鸞等[22]曾探究該基因在病毒性心肌炎小鼠心臟組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROR-γt在小鼠心臟組織中高表達。方明等[23]研究發(fā)現(xiàn)IgA 腎病患者外周血中ROR-γt基因表達水平顯著高于對照組，其認為是Th17 細胞失衡介導了IgA 腎病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，獺兔母體埋植MT 后，RORα基因在仔兔肝臟組織中呈極顯著下調(diào)；在心臟、腎臟組織中均呈顯著下調(diào)，故推測母體埋植MT 可減少Th17 細胞的分化，進而降低疾病發(fā)生的概率，有益于動物健康生長，其原因可能與母體埋植MT 有關，這在一定程度上可能對該基因的表達產(chǎn)生影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，除松果體外腸道是產(chǎn)生MT 的主要場所。Bubenik 最先證實MT 存在于腸道粘膜中[24]，且腸嗜鉻細胞是胃腸道MT 的主要來源，其分布與腸嗜鉻細胞密度呈正相關。研究證實，任何時刻腸道內(nèi)MT 濃度至少比血漿中的濃度高10～100 倍[25]。黃群等[26]證實埋植MT 后，其另一受體基因MT1mRNA 在大鼠十二指腸中表達量高于其他腸道。而本研究結(jié)果顯示，母體埋植MT 之后，RORα基因在仔兔十二指腸組織中的表達水平與對照組相比不顯著，其原因可能與飼養(yǎng)管理及營養(yǎng)水平有關。

4 結(jié) 論

本實驗條件下，母體埋植MT 后，RORα基因在仔兔皮膚、肌肉、肺臟組織中的表達與對照組相比均呈上調(diào)趨勢，因此可為母體埋植MT 以提高仔獺兔的絨毛質(zhì)量及產(chǎn)絨性能；RORα基因在仔兔肝臟、心臟、腎臟組織中的表達與對照組相比均呈下調(diào)趨勢，即可降低動物疾病發(fā)生率及促進其健康生長；RORα基因在仔兔十二指腸中的表達與對照組相比則無顯著影響。