陳 蘭 ，郭麗燕，張 濤*，張閃閃，顧若君，張跟喜，謝愷舟，王金玉

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；3.無(wú)錫三鄉(xiāng)岸農(nóng)業(yè)生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇無(wú)錫 214100）

隨著科技的飛速發(fā)展，分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展出多種測(cè)定基因表達(dá)量的方法，如半定量PCR 技術(shù)、Northern blot 技術(shù)、Western blot 技術(shù)、全基因組測(cè)序等，以上方法能精確檢測(cè)基因表達(dá)量，但操作要求嚴(yán)格，成本較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)是20 世紀(jì)末發(fā)展的新型核酸定量分析技術(shù)，具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[1-3]，該技術(shù)已被廣泛用于基因表達(dá)的相關(guān)研究。然而，RT-qPCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性一定程度上取決于內(nèi)參基因的選擇，內(nèi)參基因是為維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)而時(shí)刻都在表達(dá)的基因，其表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。在運(yùn)用RT-qPCR 技術(shù)分析靶基因的表達(dá)水平時(shí)，需要利用合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正，彌補(bǔ)因不同樣本在RNA 提取質(zhì)量及總量、逆轉(zhuǎn)錄效率和PCR 擴(kuò)增效率等可能出現(xiàn)的誤差，以期能夠準(zhǔn)確反應(yīng)靶基因間的表達(dá)差異性[4-5]。因此，內(nèi)參基因選擇正確與否直接關(guān)系到RT-qPCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性，為此，Vandesompele 等[6]、Andersen 等[7]、Pfaffl 等[8]分別開(kāi)發(fā)geNorm、NormFinder、BestKeeper 軟件和Ct 值分析法對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、beta-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、18S 核糖體RNA（18S rRNA）和核糖體蛋白S2（Ribosomal protein S2，RPS2）等均是在不同動(dòng)物RT-qPCR 研究中常用的內(nèi)參基因[9-11]。目前，利用RT-qPCR 檢測(cè)肉鴿基因表達(dá)的研究日益增多，然而有關(guān)肉鴿內(nèi)參基因選擇與穩(wěn)定性的研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)利用RTqPCR 方法檢測(cè)28 日齡乳鴿不同組織中常用內(nèi)參基因的表達(dá)，采用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件及Ct 值分析法對(duì)常見(jiàn)內(nèi)參基因在肉鴿組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，篩選出用于肉鴿組織表達(dá)研究的最佳內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為無(wú)錫三鄉(xiāng)岸生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司相同飼養(yǎng)條件下的白羽王鴿，選取28 日齡母鴿3 只，采取心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌、腹脂和卵巢組織，于裝有RNA wait 樣品保存液的無(wú)酶管中暫存，隔夜放置后于超低溫冰箱（-70℃）長(zhǎng)期保存待用。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒和RNA wait 樣品保存液均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，熒光定量PCR 板（96 孔）購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，RNA free water、Trizol、DEPC、PCR 管、異丙醇、無(wú)水乙醇、無(wú)酶管、無(wú)酶槍頭、離心管等均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 引物合成 根據(jù)GenBank 上的原鴿（Columba livia）GAPDH（登錄號(hào)：NM_001282835.1），β-actin（登錄號(hào)：XM_005504502.2）、18SrRNA（登錄號(hào)：AF173630.1）和RPS2（登錄號(hào)：XM_021300650.1）基因mRNA 序列，使用Premier 6.0 跨內(nèi)含子分別設(shè)計(jì)1 對(duì)RT-qPCR 引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR 引物

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成 使用Trizol 法提取心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌、腹脂、卵巢組織的總RNA，Nano-Drop-1000 微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)總RNA 純度和濃度，-70℃保存待用。反轉(zhuǎn)錄按照天根生化科技公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行，體系為50 μL：5×FastKing-RT SuperMix 10μL，加入1 500 ngRNA 模板，加入RNA-Free ddH2O 補(bǔ)足至50 μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度為42℃ 15 min 去除基因組及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95℃ 3min酶滅活，然后置于-20℃保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及RT-qPCR 檢測(cè) 使用SYBR Green染料熒光定量試劑盒進(jìn)行定量分析，取一定量cDNA模板按照10 倍梯度稀釋成5 個(gè)梯度，以5 個(gè)梯度濃度的cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)，利用ABI 7500 Software v2.3 軟件分析數(shù)據(jù)，生成基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。隨后利用RT-qPCR 檢測(cè)4 個(gè)基因在不同組織中的表達(dá)，20 μL 反應(yīng)體系：2×SuperReal Color PreMix 10μL，正反向引物各0.6 μL（濃度為10 μmol/μL），50×ROXReferebnce Dye 0.4 μL，cDNA 模板2 μL（濃度為：500ng/μL），RNase-free ddH2O 補(bǔ) 足 到20 μL。RTqPCR 兩步法反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用2-△ct（△Ct=各樣本最大Ct 值-各樣本最小Ct 值）方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，利用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 程序以及Ct 值差異比較分析法分析4 個(gè)內(nèi)參基因在肉鴿不同組組織中Ct 值變化，綜合評(píng)估表達(dá)穩(wěn)定性。GeNorm 軟件分析是先將2-△ct方法計(jì)算出內(nèi)參基因相對(duì)定量數(shù)據(jù)，制作Excel表格，然后將其導(dǎo)入geNorm 程序中進(jìn)行計(jì)算，獲得每個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M 值來(lái)判定出較好的內(nèi)參基因。NormFinder 程序的計(jì)算分析方法與GeNorm 程序相似，均是采用2-△ct方法計(jì)算出內(nèi)參基因相對(duì)定量數(shù)據(jù)，導(dǎo)入NormFinder 程序，獲得內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性M 值。BestKeeper 程序是采用的公式內(nèi)置的形式，主要是計(jì)算每個(gè)內(nèi)參基因之間產(chǎn)生配對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、變異系數(shù)（CV）和內(nèi)參基因Ct 值的幾何平均數(shù)（GM）產(chǎn)生BestKeeper 指數(shù)，判定標(biāo)準(zhǔn)：SD 值和CV 值越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。Ct 值分析法是采用同一內(nèi)參基因在不同組織中通過(guò)RT-qPCR 獲得的相對(duì)定量數(shù)據(jù)，計(jì)算出△ct 值進(jìn)行判定（判定標(biāo)準(zhǔn)：△ct 值越小，表達(dá)越穩(wěn)定）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 檢測(cè) 利用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 質(zhì)量，結(jié)果可見(jiàn)條帶清晰，說(shuō)明RNA 完整性良好（圖1）。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 利用已設(shè)計(jì)好的GAPDH、β-actin、18S rRNA和RPS2基因的引物，用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所得產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。在96、131、145 bp 處檢測(cè)到特異性條帶，條帶長(zhǎng)度與預(yù)期相符，條帶清晰無(wú)拖尾，說(shuō)明引物特異性良好，模板cDNA 完整性好。

2.3 各內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線分析 熔解曲線結(jié)果顯示（圖3），4 個(gè)內(nèi)參基因均為單峰，Tm 兩側(cè)均無(wú)雜峰；由表2 可知，4 個(gè)基因回歸系數(shù)R2均大于0.99，擴(kuò)增效率介于96%～111%，Ct 值和起始模板濃度對(duì)數(shù)都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明所設(shè)計(jì)引物特異性好，無(wú)引物二聚體、非特異性聚合及基因組污染而產(chǎn)生的非目的熒光。

2.4 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析 GeNorm 軟件分析，是先將2-△ct方法計(jì)算出內(nèi)參基因相對(duì)定量數(shù)據(jù)，制作Excel 表格，然后將其導(dǎo)入geNorm 程序中進(jìn)行計(jì)算，獲得每個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M 值來(lái)判定出較好的內(nèi)參基因（軟件判定標(biāo)準(zhǔn)：M 值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定，反之穩(wěn)定性就越差）。由圖4 所示，4 個(gè)內(nèi)參基因在組織表達(dá)的穩(wěn)定性各異，表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為18S rRNA＞RPS2＞β-actin＞GAPDH。

如圖5 所示，NormFinder 軟件分析4 個(gè)內(nèi)參基因在白羽王鴿的不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性M 值依次為18S rRNA＞RPS2＞β-actin＞GAPDH，根據(jù)NormFinder 程序的判定方法（M 值越小基因表達(dá)量越穩(wěn)定）篩選出最佳的內(nèi)參基因是18S rRNA，RPS2次之，β-actin的表達(dá)穩(wěn)定性高，而GAPDH最差。

如表3 所示，Bestkeeper 分析內(nèi)參基因在鴿子各組織中的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為RPS2＞18S rRNA＞βactin＞GAPDH，通過(guò)BestKeeper 程序計(jì)算，可判定RPS2內(nèi)參基因的表達(dá)最穩(wěn)定，18S rRNA次之，β-actin的表達(dá)穩(wěn)定性高，而表達(dá)穩(wěn)定性最差的是GAPDH。此分析結(jié)果與GeNorm 軟件分析的結(jié)果一致。

內(nèi)參基因分析結(jié)果顯示，18S rRNA、RPS2、β-actin和GAPDH的△ct 值分別為1.83、2.47、3.74、5.22。通過(guò)Ct 值分析法可判定18S rRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)，RPS2次之，表達(dá)穩(wěn)定性最差的是GAPDH。

表2 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、回歸系數(shù)R2 和擴(kuò)增效率

3 討 論

目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)的定量研究，為減小偏差，需要選用合適的管家基因?qū)Π谢蜻M(jìn)行校正。Lossos 等[12]研究顯示，目前還沒(méi)有能夠適用于各種細(xì)胞類(lèi)型、不同組織的內(nèi)參基因。在肉鴿中，尚未出現(xiàn)內(nèi)參基因篩選到的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，不同的分析程序得出的結(jié)果有所差異。其中，采用geNorm 程序分析，結(jié)果顯示穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因?yàn)?8S rRNA；NormFinder 程序的分析原理與geNorm 程序相似，其分析結(jié)果一致，均表明18S rRNA穩(wěn)定性最佳；利用BestKeeper 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明RPS2基因表達(dá)最穩(wěn)定，Ct 值分析法結(jié)果表明18S rRNA的△ct 值最小，穩(wěn)定性最強(qiáng)，與geNorm、NormFinder 軟件分析結(jié)果一致。

表3 Bestkeeper 分析內(nèi)參基因在鴿子各組織中的表達(dá)穩(wěn)定性的相關(guān)參數(shù)

Faccioli 等[13]研究表明利用單個(gè)管家不能保證一個(gè)公正的結(jié)果，由于不存在適合于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)基因，因此還需要在計(jì)劃實(shí)驗(yàn)的特定要求上驗(yàn)證每一個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出一套最佳的內(nèi)參基因，才能得出真實(shí)可靠的定量數(shù)據(jù)。楊顯英等[14]在評(píng)估小鼠卵巢發(fā)育過(guò)程中內(nèi)參基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，GAPDH和β-actin在小鼠的卵巢發(fā)育過(guò)程中能夠穩(wěn)定表達(dá)，是最佳的內(nèi)參候選基因組合。劉圓等[15]利用RT-qPCR 技術(shù)對(duì)茶樹(shù)在不同氮濃度處理?xiàng)l件下進(jìn)行定量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，GAPDH+β-actin組合穩(wěn)定性最佳，可作為研究茶樹(shù)基因表達(dá)的內(nèi)參基因。張蓉等[16]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)海蘭灰蛋雞的內(nèi)參基因進(jìn)行定量分析，篩選出最佳的內(nèi)參基因組合為RPS2+β-actin基因。張蓉等[17]在不同GluN 處理下產(chǎn)蛋后期籠養(yǎng)蛋雞基因表達(dá)中，能夠穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是RPS2和TBP基因。本研究通過(guò)4 種內(nèi)參基因?qū)Ｓ迷u(píng)估軟件篩選在鴿同一時(shí)期不同組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，BestKeeper 程序分析顯示RPS2基因穩(wěn)定性最好，而geNorm、NormFinder和Ct 值分析法分析顯示18S rRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)。因此，建議在白羽王鴿不同組織RT-qPCR 檢測(cè)時(shí)RPS2+18S rRNA為最佳內(nèi)參基因組合。無(wú)論是用單個(gè)內(nèi)參基因還是用多個(gè)內(nèi)參基因?qū)蚨糠治?，篩選出合適的內(nèi)參基因是得到可靠定量數(shù)據(jù)的重要前提，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為課題組今后開(kāi)展白羽王鴿基因表達(dá)分析提供了理論參考。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GAPDH基因穩(wěn)定性差，不適合作為鴿子的內(nèi)參基因；而RPS2基因和18s RNA 的穩(wěn)定性均強(qiáng)，推薦RPS2+18sRNA的內(nèi)參基因組合用于鴿子不同組織基因表達(dá)的研究。