陳啟斌,胡 薇,陳培松,趙啟波,周 斌

(1.昭通市第一人民醫(yī)院檢驗科,云南昭通 657000；2.廣州中醫(yī)藥大學順德醫(yī)院檢驗科,廣東廣州 528000；3.中山大學附屬第一醫(yī)院檢驗科,廣東廣州 510030)

珠蛋白生成障礙性貧血(下稱地貧),是人類遺傳性單基因遺傳病,以廣東和廣西發(fā)病率最高,為了防止出生缺陷,廣東省于2006年出臺了《2006年廣東省衛(wèi)生廳地貧產前診斷技術規(guī)范》中,常規(guī)產前篩查中健康備孕的夫婦雙方和孕婦血細胞分析,如平均紅細胞體積(MCV)<82 fL和/或MCH<27 pg,做血紅蛋白電泳篩查檢測；血紅蛋白電泳血紅蛋白A2(HbA2)升高,懷疑β地貧,做β地貧或/和α地貧基因檢測；HbA2正常和降低,排除缺鐵性貧血后,檢測α地貧基因,以上為地貧的正常篩查程序。實際工作中,有極少數(shù)α地貧基因攜帶者的血常規(guī)結果完全正常(表型正常),本研究旨在探討表型正常的α地貧基因攜帶者與健康人群的血常規(guī)參數(shù)的差異,建立鑒別計算公式并確定截點值,期望降低表型正常的α地貧基因攜帶者漏檢率。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年10月至2018年8月在廣州市中山大學附屬第一醫(yī)院(下稱本院)經基因檢測為α地貧基因攜帶者62例,年齡22～55歲,男30例,女32例,中位數(shù)31歲,血常規(guī)結果在正常參考范圍,紅細胞計數(shù)(RBC):(4.3～5.8)×1012/L(男)；(3.8～5.1)×1012/L(女)；血紅蛋白(Hb):130～175 g/L(男)；115～150 g/L(女)；MCV:82～100 fL(男/女)；平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH):27～34 pg(男/女)；平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC):316～354 g/L(男/女)[1],排除β地貧(β地貧常見的17種基因突變結果為陰性)和營養(yǎng)性貧血(鐵蛋白、葉酸、維生素B12結果正常),以及血液病、慢性疾病和惡病質患者。另收集在本院門診檢測無α、β地貧基因攜帶者健康體檢者98例作為對照組,血常規(guī)結果在正常參考范圍,年齡15～48歲,男54例,女44例,中位數(shù)33歲。

1.2方法

1.2.1血常規(guī)檢測方法 希森美康XN9000血液分析流水線檢測RBC、Hb、MCV、MCH、MCHC、紅細胞分布寬度(RDW),儀器定期校準,室內質控良好。

1.2.2貧血三項檢測 貝克曼生化免疫流水線檢測鐵蛋白、葉酸、維生素B12,配套試劑,室內質控良好。

1.2.3α地貧和β地貧基因檢測方法 采用達安基因磁珠法DNA提取試劑,α地貧和β地貧基因檢測試劑采用深圳亞能生物技術有限公司產品,gapPCR檢測αα/-SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.23種缺失,用反向斑點雜交檢測 αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα 3種α地貧突變和17種β地貧基因突變,設置陰陽性對照,嚴格按試劑說明書操作。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析,表型正常的α地貧基因攜帶者和健康人群的血常規(guī)參數(shù)的差異用獨立樣本t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,并且計算各鑒別公式的靈敏度(SEN),特異度(SPE),約登指數(shù)(YI)。繪制受試者工作特征(ROC)曲線并計算曲線下面積(AUC),根據(jù)最大約登指數(shù)確定截點值(cut off)。

2 結 果

2.1α地貧基因結果 表型正常的α地貧以αα/-α3.7缺失多見且占比高,αCSα/αα點突變和αWSα/αα點突變占比高但數(shù)量較少；αα/-SEA缺失和αQSα/αα百分之百的異常表型。見表1。

2.2血常規(guī)參數(shù)比較 與健康對照組比較,表型正常的α地貧基因攜帶者的RBC、HB和RDW比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05),MCH、MCV和MCHC比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01和P<0.01)。見表2。

表1 各型α地貧中表型正常的α地中海貧血分布及占比

表2 表型正常的α地貧基因攜帶者與健康人群的血細胞分析參數(shù)的比較

表3 6個鑒別診斷公式效能結果比較

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.3紅細胞參數(shù)鑒別診斷效能 在6個鑒別公式中,MCHC×MCV/10 000有高的鑒別作用,AUC達0.856,截點值在2.90%,62例中42例低于2.90%(42/62) 特異度93.50%,靈敏度73.50%；MCH×MCV/1 000 AUC達0.838,截點值在2.50%,62例中53例低于2.50%(53/62),特異度83.90%,靈敏度73.50%；MCHC×MCH/10 000 AUC達0.827,截點值在0.99%,62例中33例低于0.99%(33/62),特異度87.10%,靈敏度69.50%，見表3。按ROC曲線下面積診斷效率依次為MCHC×MCV/10 000>MCH×MCV/1 000>MCHC×MCH/10 000>MCH/MCV；MCHC/MCV、MCHC/MCH、MCV/MCH 3個鑒別診斷公式ROC曲線下面積<0.5,無鑒別診斷價值,未計算YI指數(shù)、特異度、靈敏度等指標，見圖1。

圖1 鑒別診斷公式ROC曲線

3 討 論

珠蛋白生成障礙性貧血是我國一種常見的常染色體單基因遺傳性血液病,是我國廣東、廣西[2]等南方各省發(fā)病高、影響大的遺傳性疾病。每個血紅蛋白由四條珠蛋白鏈組成,由兩條α珠蛋白鏈和兩條β珠蛋白鏈構成。α地貧的分子基礎是α2和α1珠蛋白基因缺失或發(fā)生點突變,使α珠蛋白生成減少,體內過多β珠蛋白鏈形成四聚體(β4),從而引起血紅蛋白含量、紅細胞體積等發(fā)生改變,導致溶血性貧血[3]。引發(fā)α地貧主要是αα/-SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.23種缺失,少量由αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα 3種點突變造成[4]；廣東地區(qū)和廣西地區(qū)α地貧基因型比例最高的3種也是--SEA/、-α3.7/和-α4.2/,點突變中αWSα/比αCSα/和αQSα/比例更高[5-6]；海南地區(qū)黎族人群中以-α4.2/和-α3.7/最常見,--SEA/較為少見[7]；云南地區(qū)常見基因--SEA/、-α3.7/和αCSα/[8]。

血細胞分析診斷貧血具有高效、方便、經濟、高效等優(yōu)點,如果血常規(guī)發(fā)現(xiàn)小細胞低色素性貧血,考慮缺鐵性貧血和地貧,檢測鐵蛋白等鐵代謝指標,如無缺鐵證據(jù),考慮地貧,血紅蛋白電泳篩查中HbA2>3.5%是β地貧的特征性指標[4]；如HbA2<3.5%,考慮α地貧,分別進行α地貧及地貧的基因檢測[4]。臨床上根據(jù)基因型將α地貧分為靜止型、輕型、中間型和重型,癥狀輕重不一,重型又稱胎兒水腫綜合征,引起流產或死胎的發(fā)生[9]。本研究中αα/-SEA和αQSα/αα這兩種α地貧基因型攜帶者,表型百分之百的異常,αα/-SEA為基因的大片段缺失,αQSα/αα雖然是點突變,可能突變在關鍵位點,所以表型也較重。在中國南方,特別是廣西地區(qū)常見的3種靜止型α地貧(-α3.7/、-α4.2/和αWSα/),由于沒有血液學表型的改變,血細胞分析和血紅蛋白電泳不能發(fā)現(xiàn)陽性攜帶者[4]。本研究發(fā)現(xiàn)稍有不同,發(fā)現(xiàn)αCSα/基因攜帶者中也有表型正常的。構成比中,αα/-α3.7的例數(shù)較多,αα/-α3.7血液學表型與正常參考范圍存在的差異范圍較小,αα/-α3.7缺失型α地貧存在一定的漏診率[10],和本研究一致。按照地貧篩查流程,血常規(guī)正常的靜止型α地貧(-α3.7/、-α4.2/和αWSα/)漏檢后,最大的危害是和αα/-SEA的配偶生育血紅蛋白H(HbH)病的后代。α地貧表型的多樣性與基因突變對α肽鏈合成的影響有關,當一個α基因發(fā)生缺失時,另一個正常的α基因往往代償性功能增強,而一個α基因發(fā)生突變時,另一個正常的α基因功能并不受到影響,未發(fā)生代償功能增強；因此,有些非缺失型α地貧的純合子(如αWSα/αWSα)可以表現(xiàn)為HbH病[11]。有研究認為,在HbH病中,基因型相同而血紅蛋白電泳結果及疾病的嚴重程度可存在顯著差異[12-13]。

在實際工作中,常發(fā)現(xiàn)檢測出α地貧缺失或突變,但血常規(guī)結果完全正常,會漏診這部分表型正常的α地貧基因攜帶者。α地貧表型正常組和健康對照組相比,MCV、MCH、MCHC 3個指標差異有統(tǒng)計學意義,這是筆者考慮用這3個指標組成鑒別公式的原因。α地貧表型正常組的MCV和MCHC都比健康對照組明顯降低,差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05),MCV和MCHC相乘的結果更放大差異,這是MCHC×MCV/10 000公式鑒別效能最高的原因；而α地貧表型正常組的MCH比健康對照組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),由MCH分別和 MCHC及MCV相乘的結果組成的鑒別公式MCH×MCV/1 000和MCHC×MCH/10 000鑒別效能低于MCHC×MCV/10 000。由于α地貧表型正常組的MCV、MCH、MCHC都比健康對照組減小,相互除后的結果不能放大差異,導致MCH/MCV、MCHC/MCV、MCHC/MCH及MCV/MCH這4個公式鑒別效能低的原因。通過本文數(shù)據(jù)分析,血常規(guī)表型正常的α地貧基因攜帶者的MCV、MCHC和MCH,同健康者相比,差異有統(tǒng)計學意義,通過這些有意義的指標建立鑒別診斷公式,鑒別公式中MCHC×MCV/10 000<2.9、MCH×MCV/1 000<2.5、MCHC×MCH/10 000<0.99對表型正常的α地貧基因攜帶者篩選有超過0.8的曲線下面積,有一定的參考價值,并可以通過軟件對鑒別公式計算并過濾。鑒別公式MCHC×MCV/10 000(cut off值2.895)、MCHC×MCH/10 000(cut off值0.985)、MCH×MCV/1 000(cut off值2.485)的特異度分別為93.5%、87.1%、83.9%,排除α地貧的效能依次降低。鑒別公式MCHC×MCV/10 000,除了有最高的特異度,AUC為0.856,也最高,是理想的鑒別公式。血細胞分析是診斷貧血的首要檢測項目,具有方便、經濟、高效等特點,因此在臨床中常用于鑒別患者的貧血類型[14]；基因診斷因費用貴,操作復雜,在大多數(shù)醫(yī)院及地貧低發(fā)地方的醫(yī)院不能實現(xiàn)普查,因此尋找簡單、有效、快捷的實驗的鑒別診斷方案為臨床一線,尤其是基層醫(yī)院診療提供依據(jù),減少漏診率。

臨床工作中,檢測3種常見缺失型基因(-SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα)及3種非缺失型基因(αCSα、αQSα及αWS),就能檢出約98.0% α 地貧基因[15],靳旺杰等[16]通過測序發(fā)現(xiàn)23例11種罕見的α -地貧突變基因,唐海深等[17]用多重PCR檢測少見的4種α地貧基因：--THAI、--FIL、--MED、-(α)20.5,以上這些罕見的α 地貧都未描述血液學表型,其血液學表型是否正常,將通過更多研究來補充。