宗曾艷，孔凡虹，王萌萌，熊 丹 綜述,張秀明△ 審校

(1.深圳大學第三附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，廣東深圳 518001;2.安徽理工大學醫(yī)學院，安徽淮南 232000)

環(huán)狀RNA(circRNAs)是1976年使用電子顯微鏡在RNA病毒研究中首次被發(fā)現(xiàn)的[1]，此后在人類中也檢測到了circRNA[2]。過去很長時間里，因為受檢測技術的制約，circRNA一直被認為是RNA在剪切過程中產生的無作用的錯誤產物，隨著生物信息和高通量測序技術的進步，研究人員發(fā)現(xiàn)并且鑒定了大量circRNA。與線性RNA不同，是閉合的環(huán)狀結構，能抵抗核糖核酸酶(RNase)降解，更具有穩(wěn)定性，可能在人體中有著特殊作用，現(xiàn)在的很多研究已經證實，circRNA在心血管，糖尿病，神經系統(tǒng)等疾病中均有表達上調或下調現(xiàn)象[3-5]，尤其在很多腫瘤疾病中也有異常表達，在不同的腫瘤類型和分期中發(fā)揮著抑癌基因，原癌基因或者兩者共兼的作用[6]，人們對于環(huán)狀 RNA 作為腫瘤診斷，治療等的潛力也正在逐步進行挖掘。

1 circRNA的特征及產生機制

1.1circRNA的特征 基于目前的研究，circRNA已經被發(fā)現(xiàn)具有一些獨特的特征，第一，circRNA種類繁多，含量豐富，半衰期長，對來自人類、獼猴和小鼠的多種組織的circRNA序列進行大規(guī)模研究，分別從這3個物種中發(fā)現(xiàn)了104 388、96 675和82 321個circRNA，在一些特殊情況下它的表達量甚至能達到其相應的線性mRNA的10倍以上[7-8]，并且還提示細胞質中的circRNA半衰期比與之對應的線性RNA平均20 h的半衰期更長，大多是在48 h以上，它們在各種組織、細胞、體液中都有豐富的表達[9]。第二，具有很好的穩(wěn)定性，這是因為其獨特的首尾緊閉連續(xù)環(huán)狀結構，缺乏與各種細胞蛋白相互作用所必需的帽和尾結構，而不易被核酸外切酶降解，使其更加穩(wěn)定[2]，利于檢驗人員在血漿、組織及外泌體中檢測到，并因此有望成為腫瘤標志物。第三，circRNA還具有細胞，組織和發(fā)育階段特異度，circRNA在造血細胞，血小板，紅細胞及其成熟過程中差異表達，發(fā)揮著尚未得到充分認識的作用[10]。RYBAK-WOLF等[11]的研究中對29種不同類型或不同階段的神經細胞和組織的核糖體缺失RNA進行了全面測序和分析，發(fā)現(xiàn)circRNA在大腦中具有高特異度表達。circRNA含量在神經組織[12]，尤其是突觸等永久細胞中豐度很高，其水平受神經元活動調節(jié)[13]，而在不穩(wěn)定細胞中豐度很低。在PATOP等[14]的研究中，證明了由于circRNA高的復制率使其含量被稀釋，使得circRNA豐度和細胞增殖之間存在負相關關系。第四，circRNA在物種進化中顯示出高度保守性。例如，常表達于人類中的一些circRNA，能在小鼠中檢測到，有時甚至能在果蠅的大腦中發(fā)現(xiàn)[11]。斑馬魚29% circRNA序列與人類、小鼠和腔棘細胞circRNA序列具有同源性[15]。

1.2circRNA的產生機制 在真核生物中，circRNA大多是由mRNA前體反剪接而來，反剪接是指上游外顯子的5′端與下游外顯子的3′端交替循環(huán)，產生共價閉合環(huán)狀。circRNA的來源途徑有多種，大多取決于供體的轉錄本，可能來源于外顯子[7]，內含子[16]，外顯子-內含子[17]或者來自基因間的區(qū)域[18]，外顯子circRNA含量最多，主要存在于真核生物細胞胞質中，內含子模式的主要存在于細胞核?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的外顯子circRNA主要形成過程有直接索尾連接和外顯子跳躍兩種。直接索尾連接是打破傳統(tǒng)的線性RNA剪切，而由外顯子反向剪切，將5′帽和3′尾端連接起來形成內源性環(huán)狀閉合的RNA[19]；外顯子跳躍，是指上游外顯子3′端的剪接受體位點連接到下游外顯子5′帽剪接供體位點，形成含有一個或多個躍遷外顯子的RNA套索，然后，套索中的內含子序列被移除，從而產生成熟的外顯子circRNA[20]，以第一種最為常見。

2 circRNA的調控機制

2.1circRNA作為miRNA海綿 miRNA是一類由小的非編碼RNA，通過結合相應的miRNA反應元件來調節(jié)靶標mNA的翻譯的群體，miRNA海綿是某些circRNA的主要功能。例如，cirs-7 是目前研究最為成熟的的circRNA，因其擁有70多個保守的微小反應原件，能與AGO蛋白協(xié)同影響miR-7在中樞神經系統(tǒng)中的功能[3]，Circ-TCF25作為miR-103和miR-107的海綿與膀胱癌細胞的一些惡性表型相關，能促進細胞周期蛋白依賴性激酶6 (CDK6)的表達類似的[21]，circRNA_100290可能作為一種競爭性的內源性RNA，通過吸收miR-29b家族成員來調控CDK6的表達[22]。通過微陣列分析及生物學信息和熒光素酶基因報告分析證明circRNA_0084043可能作為miR-153-3p的海綿，直接與之結合，發(fā)揮著致癌基因的作用，促進黑色素瘤的生長、遷移[23]。LI等[24]已經證實circVAPA在結直腸癌(CRC)患者組織和血漿中上調，并通過海綿miR-101在CRC中發(fā)揮致癌特性。

2.2參與基因表達的調控 一般來說，circRNA由于其在細胞內的位置和特殊結構，可以通過與RNA聚合酶協(xié)同，與作為海綿的線性RNA競爭，來調控其親代或下游基因的表達，最終在轉錄、翻譯階段改變基因表達。有研究表明[25-26]，circRNA可能在基因調控中發(fā)揮關鍵作用。

2.2.1與RNA聚合酶結合形成轉錄復合體 外顯子環(huán)狀RNA(EIciRNA)可以與細胞核中的RNA聚合酶結合來調控其自身所對應基因的表達，例如與真核翻譯起始因子3亞基J，poly (A)結合蛋白相互作用蛋白2結合，主要富集在細胞核，與U1小核核糖核酸顆粒和RNA聚合酶Ⅱ相互作用，以順式作用的方式增強親本基因的轉錄，這表明可能在轉錄水平發(fā)揮作用[27-28]。例如一個內含子circRNA(ciRNA)錨蛋白副本區(qū)域52(ciankrd52)，能夠與聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)機制相互作用，通過富集親本基因的轉錄位點，積極調控Pol Ⅱ轉錄活性，因此，敲除ci ankrd52可能降低親本基因表達[29]。

2.2.2與其他非編碼RNA競爭 circRNA與線性RNA競爭，反向剪接是circRNA形成的主要機制，規(guī)范的剪接mRNA前體(pre-mRNA)形成線性RNA，而經反向剪切形成circRNA，所以circRNA的合成通常以其線性等價物為代價的[30]，故兩者剪接形式之間存在競爭。circRNA作為一種競爭內源性RNA(ceRNA)，還可以與miRNA競爭，影響靶RNA的穩(wěn)定性或翻譯，從而在轉錄水平上調控基因表達，進而參與腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等生物學過程[31]。

2.3circRNA具有編碼蛋白的能力 傳統(tǒng)觀點，5′帽和3′尾是很重要的原件，能起始和推動翻譯，因此沒有5′帽和3′尾結構的circRNA被認為沒有編碼蛋白的功能。但是來自盲肌位點的circRNA的翻譯為circRNA具有編碼蛋白的能力提供了強有力的證據(jù)[32]。在XIN等[33]和CHEN等[27]的研究中，由外顯子，外顯子-內含子產生的circRNA具有開放閱讀框，而有翻譯成多肽或蛋白質的潛力。YUN等[34]首次發(fā)現(xiàn)了RNA最豐富的堿基修飾，即在circRNA的A甲基的第6位加N元素(m6A)，到達高效啟動蛋白翻譯作用，這種單個的m6A位點就足以驅動翻譯起始。

3 circRNA參與腫瘤進程

隨著研究的深入，已經有越來越多證據(jù)表明，circRNA與腫瘤病毒作用關系密切，調控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，參與腫瘤細胞周期，增殖過程，促進腫瘤侵襲和遷移能力，在對腫瘤早期診斷和預后等階段顯示出巨大潛力。

3.1circRNA在腫瘤發(fā)生中的研究進展 circRNA在人體中表達差異，尤其在腫瘤細胞中表達類型和豐度差異更大，因此其可能與腫瘤發(fā)生，發(fā)展有關。例如，在CHEN等[35]的研究中，表明circRNA與直腸癌，乳腺癌等腫瘤疾病的發(fā)生有關。

3.1.1調節(jié)細胞周期和腫瘤細胞增殖 細胞增殖調控是一個復雜而精確的過程，由多種信號驅動，這些信號通過調節(jié)細胞周期使細胞分裂和生長。許多研究表明，circRNA在控制腫瘤增殖方面發(fā)揮重要作用。YANG等[36]采用定量蛋白質組學，發(fā)現(xiàn)小腦退化相關蛋白1反義RNA (CDR1as)是一種罕見的致癌circRNA，對肝癌患者細胞中CDR1as調控蛋白進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)了高達330個在肝癌細胞G2期增強CDR1as表達的不同蛋白，這表明它們可能是受CDR1as調控的蛋白，因此CDR1as發(fā)揮調控蛋白作用，影響肝癌細胞的增殖周期，參與腫瘤的發(fā)生。LIANG等[37]研究結果發(fā)現(xiàn)circ-ABCB10在乳腺癌組織中表達明顯上調，在接下來的菌落形成實驗、細胞周期分析和凋亡實驗中，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，敲除circ-ABCB10基因后，G0/G1期細胞明顯增多，乳腺癌細胞不能正常分化，乳腺癌細胞增殖受到抑制，促進細胞凋亡，為臨床早期預防提供了新策略。通過雙熒光素酶檢測，有研究證明[38]circRNA_100269過表達抑制胃癌細胞增殖，與miR-630呈負相關關系，circRNA_100269和miR-630的直接相互作用構成了調控GC細胞增殖的新途徑。

3.1.2促進腫瘤侵襲和遷移 有研究[39]發(fā)現(xiàn)circHIPK3沉默能抑制鼻咽癌細胞遷移和侵襲。在YUAN等[40]的研究中，證實circ_0026344水平與結直腸癌(CRC)的進展及淋巴結轉移呈負相關關系。沉默ZKSCAN1mRNA和circZKSCAN1均可促進細胞增殖、遷移和侵襲，相反的，這兩種形式的RNA的過表達在體內和體外能抑制肝癌的生長、遷移和侵襲[41]。研究表明雄激素受體(AR)在促進透明細胞腎細胞癌(ccRCC)轉移中發(fā)揮重要作用，而circHIAT1具有抑制AR增強ccRCC細胞遷移和侵襲作用[42]。LI等[43]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中hsa_circ_0000096表達明顯低于癌旁非腫瘤組織，進一步分析表明，hsa_circ_0000096通過抑制細胞周期蛋白 D1、周期蛋白依賴激酶6(CDK6)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表達，抑制GC細胞轉移。PRMT5 circRNA通過結合海綿miR-30c誘導上皮-間質轉化，促進膀胱尿路上皮癌的遷移[44]。而ZHU等[45]的研究，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0013958在肺癌患者組織、細胞和血漿中都證實了表達上調，并且表達水平與TNM分期和淋巴轉移有關。Hsa_circ_0072995調控乳腺癌細胞的侵襲和遷移[46]。

3.1.3circRNA在病毒相關腫瘤中的作用 腫瘤病毒包括人乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒等，可引起多種腫瘤。病毒與宿主因子之間的作用機制還不是很了解，有研究表明circRNA與病毒相互作用，誘導腫瘤發(fā)生或作為病毒性circRNA和抗病毒性circRNA參與未來腫瘤的治療。在對卡波氏肉瘤(KSHV)的研究[47]中，在KSHV感染細胞和KSHV陽性患者檢測到了hsa_circ_0001400，它可以通過抑制關鍵的病毒基因而發(fā)揮抗病毒分子的作用，這是新的宿主病毒與circRNA相互作用機制，加深了筆者對這種腫瘤病毒的理解，推測在其他病毒感染導致的腫瘤中可能也有這種情況，因此這種抗病毒circRNA或病毒circRNA可能作為未來治療病毒所致腫瘤的靶點。經過UNGERLEIDER等[48]的一系列實驗，確定了廣泛的病毒circRNA可能在EB病毒感染的伯基特瘤和胃癌以及那些在病毒裂解復制的潛伏階段起著獨特的作用，該研究進一步擴展了病毒轉錄組的功能，并為發(fā)現(xiàn)EBV如何促進感染、誘導腫瘤發(fā)生的新機制奠定了基礎。在TOPTAN等[49]的研究中，發(fā)現(xiàn)EB病毒(EBV)和卡波氏肉瘤皰疹病毒(KSHV)能導致2%的人類癌癥，包括EBV陽性的Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌等，EBV和KSHV都能編碼circRNA，是一類新的病毒轉錄產物，在病毒相關腫瘤中表達，可能有助于病毒的致癌，為在腫瘤病毒發(fā)病機制中發(fā)揮作用的新形式的病毒基因表達研究提供了一個方向。ZHANG等[50]發(fā)現(xiàn)circRNA (circ-Vav3)在 宿主或宿主細胞感染禽白血病病毒J亞群(ALV-J)后表達上調，circ-Vav3通過增強gga-miR-375靶基因YAP1表達，進一步研究證實了circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1軸可以影響上皮間質轉化(EMT)，而促進禽類肝臟腫瘤形成。高危人乳頭瘤病毒E7癌基因的表達是維持惡性表型和轉化的必要條件，ZHENG等[51]首次全面描述了HPV-16 E7調控的circRNA在宮頸癌細胞中的表達譜，直接證明了病毒致癌基因有可能影響多個circRNA的豐度，促進HPV陽性癌細胞的生長。這些研究增加了筆者對circRNA與病毒相關的腫瘤機制的認識。

3.2circRNA在腫瘤診斷中的研究進展 臨床上對惡性腫瘤的早期診斷對于患者的治療，預后十分重要。腫瘤診斷領域一直是全球科學家研究的熱點，新的腫瘤診斷方法不斷涌現(xiàn)，而非侵入性生物標志物或液體活組織檢查有可能很大程度上促進腫瘤癥患者的生存率，因為可以重復采樣以便實時，動態(tài)監(jiān)測疾病進展，這兩者都是個性化醫(yī)療的基石?，F(xiàn)有的診斷腫瘤的技術包括核磁共振成像、CT、病理組織切片等費用昂貴，并且需要注射造影劑，對人體有一定創(chuàng)傷性。而circRNA的穩(wěn)定性，特異度，含量豐富，在腫瘤組織與正常組織中表達異常等特征，是未來作為惡性腫瘤早期診斷的理想的標志物[52]。現(xiàn)有的研究表明，hsa_circ_0000190可能是一種新的無創(chuàng)胃癌診斷生物標志物，其靈敏度和特異度均優(yōu)于常用的CEA、CA19-9等生物標志物[53]。hsa_circRNA_100395等關鍵的circRNA有望作為 乳頭狀甲狀腺癌的診斷生物標志物[54]。ZHU等[45]的研究結果表明，hsa_circ_0013958可以作為一種潛在的無創(chuàng)生物標志物，用于肺腺癌的早期診斷和篩選。

3.3circRNA在腫瘤預后中的研究進展 有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在判斷腫瘤預后情況和預測復發(fā)中起著重要作用。在YUAN等[40]的研究中，通過異種移植實驗，表明circ_0026344過表達能促進細胞凋亡，提示circ_0026344是一種抑制基因，低表達預測CRC患者預后不良，可作為未來臨床判斷CRC預后情況指標。在另外一個研究中，運用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PC)對102個肝癌患者(HCC)的樣本進行了微陣列分析發(fā)現(xiàn)，circZKSCAN1表達明顯低于相鄰非腫瘤組織中，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且將會以此建立該腫瘤的相關預后標志物[41]。在一個類似的肝癌研究中[55]，circMTO1被證明作為miR-9致癌的海綿能促進p21的表達，抑制HCC的進展，提示circMTO1是HCC治療有利的結合位點，而HCC組織中circMTO1的表達降低可能是患者生存期較差的預后指標。SHUAI等[56]的研究成果表明，circRNA_0000285可能是鼻咽癌患者預后的一個獨立預后因素，提示circRNA_0000285可能是鼻咽癌的一種新的生物標志物并與鼻咽癌的放射敏感性有很大關系。類似的。有研究[39]表明circHIPK3表達水平也可以作為鼻咽癌患者預后的一個指標。circPRMT5作為一種新型的致癌circRNA，也是膀胱尿路上皮癌的預后標志物[44]。circ-FBXW7I編碼功能蛋白FBXW7-185aa，可能對膠質瘤的預后有潛在的影響[57]。

4 該領域存在的問題

該領域的研究仍存在一些不足。首先，對circRNA的識別、量化、驗證以及過表達和沉默方法都依賴于特定的反剪接，由于單個circRNA的序列與其同源的線性RNA亞型完全重疊，因此分析circRNA的功能意義一直是一個挑戰(zhàn)[58]。第二，關于其轉錄后調控機制仍有待探索。例如，還不了解它們最終如何被降解，以及它們的結構如何與相對應線性RNA產生功能差異的。第三，專門用于確定circRNA的生物信息學預測仍處于初級階段，circRNA的命名大多數(shù)是根據(jù)其功能命名的，而沒有明確，正式的規(guī)則[35]，命名標準化將有助于生物信息學和circRNA起源和功能的實驗研究。雖然現(xiàn)在已經建立了幾個數(shù)據(jù)庫，但基于生物信息學的方法也會出現(xiàn)誤差，因此應謹慎處理對circRNA的注釋，并結合多種算法，及時更新數(shù)據(jù)庫，便于更全面準確地利用這些數(shù)據(jù)庫。第四，除了經典的反剪接和外顯子跳躍形成circRNA外，還有其他剪接或轉錄后修飾的模式可能存在，例如通過逆轉錄酶的模板切換、串聯(lián)復制等[58]。此外，現(xiàn)有的檢測方法還難以對circRNA和其他類型的微小RNA進行準確的區(qū)分。雖然Northern blot方法因其直觀準確、不容易出現(xiàn)模板切換等特點，被提議為circRNA研究的金標準[27]，但更為準確的研究技術還有待于進一步開發(fā)。

5 總 結

目前，對circRNA特征及功能方面的研究已比較成熟。circRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移方面的調控機制研究也取得了很大進展。但circRNA在臨床應用方面還存在一些不足。如circRNA應用于疾病分子標志物還缺乏大批量臨床驗證，還停留于基礎研究階段，難以做到向臨床轉化。根據(jù)以往研究，circRNA主要功能之一是充當miRNA海綿。因此，通過研究內源性環(huán)狀海綿結構，結合位點等，設計和開發(fā)有效的人工海綿，或者根據(jù)其特殊的反剪接形成機制研究出能增強有利circRNA表達和沉默有弊circRNA的新藥物，在不產生副作用的情況下調控人體中circRNA豐度，最大限度的將circRNA運用于臨床。