徐陽(yáng)颺，李志夫，趙越薇，李富升，婁加陶

(上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200030)

抗酸染色鏡檢是檢驗(yàn)分枝桿菌的重要方法[1-2]，長(zhǎng)期以來(lái)依靠手工染色。手工染色效果的穩(wěn)定性欠佳，建立標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程難以從根本上消除人員之間的差異，容易造成結(jié)果的誤判，且不利于實(shí)驗(yàn)室生物安全[3-4]。近年來(lái)，隨著微生物檢驗(yàn)技術(shù)呈現(xiàn)自動(dòng)化的趨勢(shì)，微生物自動(dòng)染色儀受到了廣泛的關(guān)注[5-7]，聲稱具有標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化、效率高、污染小等特點(diǎn)。本研究擬評(píng)估RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)微生物標(biāo)本抗酸染色的性能。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年1-12月本院檢驗(yàn)科微生物室收到臨床樣本和質(zhì)控片。痰和支氣管沖洗液涂片83例(其中痰陰性20例、陽(yáng)性29例；支氣管沖洗液陰性20例、陽(yáng)性14例)、分枝桿菌培養(yǎng)物涂片30例(其中陰性20例、陽(yáng)性10例)、室內(nèi)質(zhì)控片20張(上海市臨檢中心抗酸染色室內(nèi)質(zhì)控片)、室間質(zhì)評(píng)片10張(上海市臨檢中心2017年第一次和第二次結(jié)核菌涂片室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目)。

1.2儀器與試劑 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀(RAL DIAGNOSTICS)、KIT RAL-STAINER Cold ZN抗酸染色試劑盒(RAL DIAGNOSTICS)、快速抗酸染色液(冷染法，珠海貝索)、BBL MGIT分枝桿菌培養(yǎng)管(BD)。

1.3方法

1.3.1染色前處理 痰和支氣管沖洗液樣本經(jīng)消化、濃縮、集菌處理后，棄去上清，將沉淀涂至玻片，干燥固定，紫外線消毒30 min后染色。質(zhì)控片固定5 min后染色。吸取分枝桿菌培養(yǎng)物至玻片并加血清固定，干燥后，紫外線消毒30 min后染色。

1.3.2染色 手工法抗酸染色按照《臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作(第三版)》[8]進(jìn)行，儀器法抗酸染色按照原廠說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3鏡檢 在普通光學(xué)顯微鏡下觀察各類抗酸染色片的片膜完整程度、全片染色均勻程度、染色色澤、染料沉渣情況、鑒別特征(背景中的細(xì)胞和抗酸陰性細(xì)菌的顏色、抗酸桿菌的顏色和形態(tài))等。并按照《臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作(第三版)》[8]進(jìn)行抗酸桿菌計(jì)數(shù)。

1.3.4評(píng)估內(nèi)容和結(jié)果判斷 (1)染色效果的合格率：片膜完整、全片染色均勻、染色色澤鮮明、染料沉渣很少、鑒別特征明顯(背景中的細(xì)胞和抗酸陰性細(xì)菌呈藍(lán)色，抗酸桿菌呈粉紅色并能觀察到不同形態(tài))。此為合格標(biāo)準(zhǔn)。(2)染色結(jié)果的一致率：手工法與儀器法的染色結(jié)果，抗酸桿菌計(jì)數(shù)可以上下浮動(dòng)一個(gè)加(分枝桿菌培養(yǎng)物涂片不算加號(hào)幅度)，陰性不能為陽(yáng)性，陽(yáng)性不能為陰性。此為一致標(biāo)準(zhǔn)。(3)儀器染色的重復(fù)性：分別選取各類標(biāo)本陰性、陽(yáng)性各1例，重復(fù)涂片10張并用儀器染色，觀察每例標(biāo)本重復(fù)染色的結(jié)果。每例標(biāo)本的10張涂片染色結(jié)果的一致率≥80%，表示儀器染色的重復(fù)性合格。(4)與室間質(zhì)評(píng)預(yù)期結(jié)果的符合率：兩次室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分別≥80%符合預(yù)期為符合。(5)交叉污染和工作性能。對(duì)痰和支氣管沖洗液涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物涂片評(píng)估(1)、(2)、(3)、(5)，對(duì)室內(nèi)質(zhì)控片評(píng)估(1)，對(duì)室間質(zhì)評(píng)片評(píng)估(1)、(4)。

2 結(jié) 果

2.1染色效果的合格率 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)痰和支氣管沖洗液涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物涂片、室內(nèi)質(zhì)控片、室間質(zhì)評(píng)片進(jìn)行抗酸染色，所有涂片片膜完整、全片染色均勻、染色色澤鮮明、染料沉渣很少、鑒別特征明顯(背景中的細(xì)胞和抗酸陰性細(xì)菌呈藍(lán)色，抗酸桿菌呈粉紅色并能觀察到不同形態(tài))。各類涂片染色效果的合格率為100%。

2.2染色結(jié)果的一致率 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)痰和支氣管沖洗液涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物涂片抗酸染色結(jié)果的一致率均為100%，見(jiàn)表1、2。

表1 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)痰和支氣管沖洗液涂片抗酸染色結(jié)果的一致率

表2 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)分枝桿菌培養(yǎng)物涂片抗酸染色結(jié)果的一致率

2.3儀器染色的重復(fù)性 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)痰和支氣管沖洗液涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物涂片抗酸染色結(jié)果的重復(fù)性均為100%，見(jiàn)表3。

表3 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)痰和支氣管沖洗液涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物涂片抗酸染色結(jié)果的重復(fù)性

2.4與室間質(zhì)評(píng)預(yù)期結(jié)果的符合率 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)兩次室間質(zhì)評(píng)片抗酸染色的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合率均為100%，見(jiàn)表4。

2.5交叉污染 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀批量染色時(shí)，無(wú)交叉污染。

表4 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)室間質(zhì)評(píng)片的抗酸染色結(jié)果

2.6工作性能 RAL-STAINER自動(dòng)染色儀抗酸染色與手工抗酸染色相比，操作更簡(jiǎn)便、通量更高、染色效果更穩(wěn)定、人員效率更高、生物安全性更好。另外，該染色儀還具有程序可優(yōu)化、無(wú)交叉污染、占空間小、質(zhì)量可溯源等的特點(diǎn)。

3 討 論

傳統(tǒng)的抗酸染色采用手工方法，影響因素較多，人員間容易存在差異。尤其是染液量、染色時(shí)間、沖洗水量與速度、脫色液脫色程度的判斷等細(xì)節(jié)存在人為的不穩(wěn)定因素，偶爾甚至?xí)┘?、錯(cuò)加試劑，造成不必要的麻煩。手工染色需要連續(xù)操作，在大樣本量的情況下，需要占用人員連續(xù)的工作時(shí)間，人員活動(dòng)度小，整體工作效率不高。另外，染色過(guò)程中試劑揮發(fā)或形成氣溶膠對(duì)人體和環(huán)境傷害較大，不利于實(shí)驗(yàn)室生物安全。

RAL-STAINER自動(dòng)染色儀采用原裝配套抗酸染色試劑盒，具有質(zhì)量溯源性。采用自動(dòng)化浸泡式染色程序，抗酸染色試劑第一液位固定液，可防止片膜脫落和交叉污染。共2個(gè)樣本裝卸區(qū)，一次最多可供20張玻片批量染色。其高通量、快速染色的特點(diǎn)對(duì)于大樣本量的情況尤其具有優(yōu)越性。儀器內(nèi)部集成了風(fēng)扇，染色后自動(dòng)烘干玻片。系統(tǒng)全封閉，除更換試劑外無(wú)需再接觸試劑。配有廢液容器和活性炭過(guò)濾器，減少了試劑揮發(fā)和氣溶膠形成對(duì)人體和環(huán)境的傷害。染色過(guò)程全自動(dòng)，節(jié)約了人員，提高了工作效率。體積小巧，不占空間。

本研究評(píng)估了RAL-STAINER自動(dòng)染色儀對(duì)微生物標(biāo)本抗酸染色的性能。痰和支氣管沖洗液是抗酸染色送檢的主要標(biāo)本類型。結(jié)果表明，該儀器對(duì)痰和支氣管沖洗液涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物涂片、室內(nèi)質(zhì)控片、室間質(zhì)評(píng)片進(jìn)行抗酸染色，各類涂片染色效果的合格率高。儀器法和手工法對(duì)痰和支氣管沖洗液涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物涂片抗酸染色結(jié)果的一致率高。儀器染色重復(fù)性好，有助于減少人為誤差。采用該儀器對(duì)室間質(zhì)評(píng)片進(jìn)行抗酸染色，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全符合。痰和支氣管沖洗液為濃縮集菌后的涂片、分枝桿菌培養(yǎng)物為從液體培養(yǎng)基中吸取的物質(zhì)進(jìn)行涂片、室內(nèi)質(zhì)控片和室間質(zhì)評(píng)片為直接痰涂片，染色儀對(duì)于幾種涂片方式都具有良好而穩(wěn)定染色效果。

當(dāng)然，RAL-STAINER自動(dòng)染色儀也具有一定的局限性。由于其系統(tǒng)開(kāi)放性小，需要采用配套原裝試劑，成本相對(duì)較高。耗材的定期和按需更換(如過(guò)濾器、蠕動(dòng)泵皮條等)有助于維持儀器正常的生物安全和排廢功能。感應(yīng)器功能的穩(wěn)定有賴于定期的清潔和維護(hù)保養(yǎng)。配套玻片架夾取的玻片厚度應(yīng)適宜，以防架齒松動(dòng)使玻片掉落。排水管出口或廢液桶高度最好低于儀器，以便形成高度差后順利排水，對(duì)空間有一定要求。偶見(jiàn)機(jī)械臂故障，需要復(fù)位后，根據(jù)實(shí)際染色進(jìn)程設(shè)置新的染色程序，完成后續(xù)染色工序。至于本研究的局限，在今后的研究中增加標(biāo)本來(lái)源和標(biāo)本量可能有助于提高統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié) 論

RAL-STAINER自動(dòng)染色儀操作簡(jiǎn)便、染色程序標(biāo)準(zhǔn)化、通量高、染色效果穩(wěn)定、無(wú)交叉污染，對(duì)微生物標(biāo)本抗酸染色有良好的工作性能，有利于提高工作效率和保護(hù)生物安全。