李 翠，王 兆，萬建青，徐 嫄，鄒興啟，朱元源，徐 璐，張乾義，夏應(yīng)菊，王 琴，郎洪武，趙啟祖

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，簡稱WHO)的核心職能是發(fā)展、建立和推進食品、生物制品、藥品及類似產(chǎn)品的國際標準化以及診斷程序的標準化。WHO已經(jīng)建立了用于預(yù)防、治療和診斷人類疾病或異常情況相關(guān)的國際生物制品標準物質(zhì)，以便于在世界范圍內(nèi)以相同形式表示此類生物制品的活性，為測量提供統(tǒng)一基礎(chǔ)。

要保證各國或各區(qū)域生物制品標準物質(zhì)的一致性，就必須建立相應(yīng)的指導(dǎo)原則。1978年，WHO生物標準化專家委員會(Expert Committee on Biological Standardization, ECBS)首次制定了“關(guān)于生物制品標準物質(zhì)制備和建立的指導(dǎo)原則”[1]。該指導(dǎo)原則旨在促進各國和各區(qū)域負責生物制品標準物質(zhì)工作的相關(guān)機構(gòu)進一步合作，為制備和建立生物制品標準物質(zhì)提供技術(shù)指南。1986年和1990年，ECBS對指導(dǎo)原則進行了2次修訂[2-3]，2004年提出了最新修訂版的指導(dǎo)原則[4]。下面對其進行詳細介紹，以期為我國獸用生物制品標準物質(zhì)制備程序的制定和相關(guān)標準物質(zhì)的研制提供參考依據(jù)。

1 WHO國際生物制品標準物質(zhì)制備指導(dǎo)原則總述

WHO國際生物制品標準物質(zhì)由組分復(fù)雜的物質(zhì)組成，需要以生物學或免疫學方法對其準確定性。這些生物學或免疫學方法一般是相對的，而不是絕對的，所以標準物質(zhì)在確定其生物學或免疫學反應(yīng)的定性和相對定量上起關(guān)鍵作用。

WHO采用的生物標準化原則包括：標準物質(zhì)的賦值是一個任意單位值而不是絕對單位值(但也有例外)；標準物質(zhì)的單位是以物理存在形式定義的；標準值的確定可以基于參考方法或多種方法；標準物質(zhì)的性質(zhì)應(yīng)該與檢測系統(tǒng)中被測樣品的性質(zhì)越相似越好。

生物制品具有不同類型的生物學活性，因此應(yīng)分別建立作為生物學和免疫學標準的標準物質(zhì)；給同一標準物質(zhì)賦予不同類型的生物學活性；多數(shù)情況下，尤其是在體外診斷學領(lǐng)域，國際標準物質(zhì)是被用于定性的而不是定量的，在這種情況下建立的標準物質(zhì)可能并不被賦予國際單位，有時可能連活性賦值都沒有，而是以某種適當?shù)奶匦宰鳛榛钚詥挝毁x值。以前，未被賦予國際單位的標準物質(zhì)被稱為國際生物制品參考品，但這兩種類別間并無明確界限。在此修訂本中，取消了該說法。在對生物制品標準物質(zhì)候選物作任何研究之前都必須清楚它是否作為定性檢驗用，因為這會影響研究的設(shè)計。必要時可能還需建立一組對照品來評價診斷試驗。如ECBS建立了一組由10個不同基因型的Ⅰ型人免疫缺陷性病毒(HIV-1)組成的參考品組來評價HIV-1的核酸擴增試驗的特異性，該組參考品被確定為第一個HIV-1基因型國際參考品組，而其中的每個基因型并未被單獨賦予單位量[5]。

正如ISO 17511[6]標準中規(guī)定的，某種程度上，普通計量術(shù)語——不確定度已根據(jù)體外診斷領(lǐng)域的新規(guī)定逐漸被應(yīng)用于生物制品標準物質(zhì)，但國際生物制品標準物質(zhì)被賦予任意國際單位值時，并未給出不確定度值。

2 國際生物制品標準物質(zhì)的制備、鑒定和建立

WHO用于建立標準物質(zhì)的生物制品常由不同組分的物質(zhì)混合而成，常存于復(fù)雜基質(zhì)(如血清或血漿)中，而未被很好地鑒定。國際生物制品標準物質(zhì)不需要很高的純度。但當某一生物制品標準物質(zhì)需要換批時，即使該制品的特殊活性已改變，也要盡量保證換批標準物質(zhì)生物活性的國際單位具有連續(xù)性。國際生物制品標準物質(zhì)的數(shù)量相對有限，主要被用于鑒定和校準地區(qū)、國家或其他的二級標準物質(zhì)，二級標準物質(zhì)是常規(guī)使用的工作用標準物質(zhì)。

指導(dǎo)原則對所用術(shù)語給出了定義，并對WHO標準物質(zhì)進行了以下分類。標準物質(zhì)是指在檢測中具有校準作用的物質(zhì)。國際生物制品標準物質(zhì)是指為保證全球范圍內(nèi)生物學或免疫學測定結(jié)果的表示形式一致的標準物質(zhì)，其活性值由WHO賦予國際單位IU值或其他適宜的單位。候選物的選擇應(yīng)滿足所需目的，在第一次建立國際標準物質(zhì)時，其活性單位值是在國際協(xié)作研究后人為決定的；在換批國際標準物質(zhì)時，其活性單位值由上一批標準物質(zhì)溯源而得。參考品是指其活性由WHO以某種單位而賦予的標準物質(zhì)。該類標準物質(zhì)是臨時性的，在后來的建立期間，需積累獲得足夠的信息以使參考品被鑒定為國際標準物質(zhì)。只有當參考品被最終確定為國際標準物質(zhì)時，其效力才能以國際單位表示。經(jīng)國際協(xié)作研究后，參考品的活性值被賦予國際單位，其值應(yīng)與已賦予的單位值一致，若不同，必須有科學、合理的原因。建立參考品的特殊要求另有規(guī)定，明顯不同于有關(guān)建立WHO國際生物制品標準物質(zhì)的一般要求。國際參考品組是指由一組標準物質(zhì)組成，共同輔助評價檢測方法或診斷實驗。

2.1 質(zhì)量保證

2.1.1 質(zhì)量管理體系 生物制品標準物質(zhì)的獲得、制備、貯存和分發(fā)應(yīng)當在特定的質(zhì)量管理體系下進行。國際上推薦的體系可以從ISO獲得[7-8]。

2.1.2 報告 按照質(zhì)量體系的要求，保存完整的記錄是很重要的。另外，目標標準物質(zhì)的制備背景和建議、負責人及其職責、原材料的檢測證書、標準物質(zhì)分裝到容器前、中、后過程中進行的檢測和試驗(包括剩余水分和均勻性的質(zhì)量控制試驗)、穩(wěn)定性試驗、協(xié)作研究的原始數(shù)據(jù)、報告和建議、參與者贊成或反對意見的報告、貯存和分發(fā)等也是重要的。

2.1.3 方法確認 質(zhì)量體系應(yīng)當清楚地確定關(guān)鍵的設(shè)備和技術(shù)，并且制定出其功能確認和維護的程序。這些關(guān)鍵設(shè)備包括但不受限于冷凍或其他過渡點確定的分析設(shè)備、分裝液體到安瓿或小瓶中的處理設(shè)備、凍干機、無菌填充隔離設(shè)備、安瓿或小瓶的密封設(shè)備、實施過程的控制設(shè)備、維持無菌/潔凈間的空氣過濾設(shè)備、滅菌/清洗和水純化設(shè)備及保存設(shè)備等。

2.2 對建立國際生物制品標準物質(zhì)的必要性進行評估 建立國際生物制品標準物質(zhì)需要滿足以下條件：在已批準或?qū)⒁鷾实纳镏破返臋z驗或定性中使用，并在多個國家分發(fā)；在醫(yī)藥或?qū)嶒炇覚z驗中對生物制品的鑒定起重要作用；區(qū)域、國家或者實驗室使用生物制品標準物質(zhì)進行校準。

ECBS通常不建立只用于科學研究的生物制品標準物質(zhì)。但是，如果用于科學研究的生物制品標準物質(zhì)是用于國際公共健康的，則可以制備。

當其他組織確定需要一種國際生物制品標準物質(zhì)，就應(yīng)當告知WHO，并且告知WHO該組織是否愿意繼續(xù)該標準物質(zhì)的研究，以避免不必要的重復(fù)工作。同其他標準物質(zhì)研制機構(gòu)共同協(xié)作來建立標準物質(zhì)是非常重要的。

2.3 原材料的本質(zhì)、來源和保存 生物制品標準化的重要原則是在試驗方法使用的檢測體系中標準物質(zhì)應(yīng)當盡可能的接近試驗樣品。所以，候選物的選擇應(yīng)當反映檢測方法中“相似性”的這一原則。選擇的原材料應(yīng)當具有高度的穩(wěn)定性和特異性，或者對于其采用的分析或試驗方法來說具有充分的濃度含量。雖然原材料不需要具有最高的純度，但也不應(yīng)該存在其他成分干擾原材料所采用的檢測方法。

原材料通常從單一來源獲得，它可以是單一批次的部分或者全部。這對由人提供而獲得的原材料來說是困難的，在這種情況下，大樣本的一小部分對小樣本的一大部分來說是首選的原材料。對于由工業(yè)加工制備的原材料，原材料的提供者應(yīng)當提供批次分析證書。在未經(jīng)提供者允許的條件下，這一信息不能透露給使用者。

如果需要從多個批次或來源的原材料庫來制備原材料，那么應(yīng)當保證完全混合原材料，而且是均勻的。對于含有蛋白的液體原材料，在混合過程中應(yīng)當考慮避免變性。另外，單一批次在混合前進行的任何研究都應(yīng)說明可以做到均勻性混合。

為了適合作為國際標準物質(zhì)，最終分裝到容器中的原材料的量應(yīng)該充分滿足評估的需要，而且最好至少滿足10年需要。在起草目標標準物質(zhì)制備方案時，應(yīng)當考慮制備換批標準物質(zhì)所采用的方法。為了使單位的不連續(xù)性最小化，獲得并擁有超額的候選原材料，則可用同樣的材料替代；一旦可以保證穩(wěn)定性，標準物質(zhì)的延續(xù)性可以通過制備大批量來保證,如超過20000安瓿。需要分裝的原材料的量將依賴于評估的需要，如果該材料僅被很少的實驗室采用，那么很少的量就足夠了。

原材料在分裝到最終容器之前必須保存在適當條件下。建議最佳的儲存條件應(yīng)當從該批次原材料獲得的制備者那里獲得。在其保存在適宜條件前，從原材料中取出足夠用于所有試驗需要的樣品。這些樣品在用于試驗前也應(yīng)當被保存在同原材料相同的條件下。

如果干燥原材料不能使它們喪失生物學活性，而且復(fù)溶后它們能保持充分的活性并具有適當?shù)奈锢硖匦裕敲纯梢愿稍镄问奖４?。液體原材料通常應(yīng)當冷凍保存，而且應(yīng)當采取專門的措施保證獲得適當?shù)睦鋬?。如果液體原材料是無菌的或者含有抗微生物的防腐劑，可以保存在2～8 ℃。盛裝原材料的容器應(yīng)當能耐受冷凍、保存、融化、開封或必要時凍干等這樣的條件，而且保存條件都應(yīng)當保證保存材料的生物學活性。

2.4 最終生物制品標準物質(zhì)的特性 應(yīng)當測定容器中最終生物制品標準物質(zhì)的剩余水分、殘氧量、不含有微生物污染的證據(jù)及效力或生物學活性。

2.4.1 剩余水分測定 檢測物質(zhì)的量依賴于使用的檢測方法以及批量大小。檢測的量是通過預(yù)定取樣方案來確定的。最廣泛使用的方法是庫氏(Coulometric Karl Fischer)滴定法。制劑的剩余水分含量少于1%(W/W)可表現(xiàn)長時間的穩(wěn)定性。有些情況下更高的值如5%也是合適的。由于凍干物質(zhì)都具有吸濕性，所以在檢測過程中應(yīng)當采取必要措施以避免吸收水分。

2.4.2 殘氧量測定 檢測物質(zhì)的量依賴于使用的檢測方法以及批量的大小。檢測的量是通過預(yù)定取樣方案來確定的。測定時應(yīng)至少采用3個容器，確認容器中的氣體是惰性的，而且容器中的物質(zhì)得到抗氧化性的保護。在大氣壓力下采用氧燃料電池計或質(zhì)譜測定氧水平低于45 μmol/L時能充分保證長時間的穩(wěn)定性。如果方法已經(jīng)得到充分確認，那么不需要每批新的安瓿都進行殘氧量測定。

2.4.3 特性及效力或生物活性 采用適當?shù)姆椒ㄗC明容器中的生物制品保留其完整性、組分及效力或生物活性是非常重要的。

2.5 最終產(chǎn)品的穩(wěn)定性 應(yīng)在不同條件下通過確定標準物質(zhì)效力或活性喪失的速度等方式進行穩(wěn)定性監(jiān)測，通?？紤]以下三個原因：提供標準物質(zhì)在確定的保存條件下適合于其目標用途的評估時間；確定標準物質(zhì)分發(fā)到使用者的最佳條件；確定標準物質(zhì)在重新溶解后保持其活性的持續(xù)時間。

由于標準物質(zhì)是由其本身來確定活性單位的，幾乎不能得到獨立的衡量標準，因此在標準物質(zhì)確定的保存條件下沒有直接的方法評估其效力喪失的速度。喪失速度的測定是采用間接的近似方法進行的。這些方法一般以Arrhenius公式給定的反應(yīng)速度和溫度之間的關(guān)系為依據(jù)，且最初預(yù)定的反應(yīng)速度通常都是假設(shè)的。采用這些方法需要將標準物質(zhì)樣品保存在一系列升高的溫度下，以預(yù)測保存在較低溫度下的標準物質(zhì)的相對效力。Kirkwood[12-14]根據(jù)最大相似方法描述了一個迭代程序來評估降解速度和溫度間相關(guān)因素的參數(shù)。

熱加速降解研究的數(shù)據(jù)也可以應(yīng)用到在標準物質(zhì)分發(fā)過程中預(yù)期更高溫度下相似的活性喪失，而且也可以應(yīng)用于確定分發(fā)的適宜條件。

重新溶解后物質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)信息也應(yīng)提供給使用者。有關(guān)影響重新溶解后物質(zhì)的特性的其他信息，例如特殊類型容器的吸附性，也應(yīng)當給出。由于重新溶解和保存條件不能在很多合作研究中廣泛進行研究，所以此類信息是有限的。鼓勵使用者將他們在常規(guī)實驗室條件下使用標準物質(zhì)進行的研究信息反饋給WHO或管理實驗室。

用于生物制品標準物質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)測的分析方法是否合適，取決于標準物質(zhì)的本質(zhì)和用途。穩(wěn)定性研究需要的實驗室數(shù)量一般少于評估候選物是否合適的協(xié)作標定的實驗室數(shù)量。國際標準物質(zhì)不指定有效期，而是根據(jù)存在的數(shù)據(jù)預(yù)測長期的穩(wěn)定性。

2.6 國際協(xié)作研究 國際協(xié)作研究必須在ECBS考慮確定生物制品標準物質(zhì)候選物之前進行，并且我們不可低估執(zhí)行該研究的工作量及所需的資源。對于由WHO標準化實驗室或其他WHO協(xié)作中心執(zhí)行的標準化項目，WHO必須通過ECBS了解協(xié)作實驗室承擔工作的意向，及是否認可建立候選物的原則，以避免不必要或重復(fù)性的工作。在建立國際標準物質(zhì)工作原則上達成一致后，WHO可以通過ECBS或者特殊項目的具有法律職責的工作組來對研究工作的大概提出一些建議。ECBS不會涉足協(xié)作研究設(shè)計的細節(jié)問題。協(xié)作研究必須由一個或多個熟悉生物學領(lǐng)域的科學家組織，如有經(jīng)驗的生物統(tǒng)計學家[15]。具體要求詳見《世界衛(wèi)生組織國際生物制品標準物質(zhì)協(xié)作研究技術(shù)要求》。

2.7 需提供的詳細資料 ECBS要求提供與標準物質(zhì)有關(guān)的詳細資料，以判斷該標準物質(zhì)可否被接受為某一制品的國際生物制品標準物質(zhì)候選物。有關(guān)建立暫時性參考品需要提交的資料在《建立世界衛(wèi)生組織國際生物制品標準物質(zhì)需提交詳細資料信息》中另有規(guī)定。

2.8 國際生物制品標準物質(zhì)的建立 滿足以下條件時，WHO可能會建立某種國際生物制品標準物質(zhì)：已準備好協(xié)作研究報告，所有的協(xié)作研究者都對該報告做出了評論，并且這些評論和報告已被提交給ECBS；很好地解答了工作組或WHO邀請的其他同行評議后所提出的疑問；很好地解答生物制品檢定顧問專家組成員在檢查完所需提交的詳細資料后所提出的疑問?；谒峤坏脑敿氋Y料和專家的建議材料，ECBS做出統(tǒng)一決定，專家委員會的決議最終由WHO負責主管簽署。

在WHO技術(shù)報告系列中列出了迄今為止WHO建立的所有國際生物制品標準物質(zhì)，該系列報告及當前的最新版本可在WHO網(wǎng)站(www.who.int/biologicals)查閱。已建立及被廢棄的標準物質(zhì)以附件的形式附于ECBS會議報告中。用戶也可從標準物質(zhì)管理實驗室獲得其紙質(zhì)或電子版本。

2.9 國際生物制品標準物質(zhì)的保存和發(fā)放 管理實驗室代表WHO保存和發(fā)放國際生物制品標準物質(zhì)。上述的標準物質(zhì)目錄中給出了管理實驗室負責哪些特殊標準物質(zhì)的特性。管理實驗室的關(guān)鍵職責是要有完備的應(yīng)變計劃來維護所保存物質(zhì)的完整性[16]。WHO鼓勵標準物質(zhì)管理實驗室確定和維持足夠數(shù)量的每一種國際標準物質(zhì)的非現(xiàn)場保存，以防整個保存設(shè)備發(fā)生災(zāi)難性損壞或丟失時而需要進行的換批。在適當情況下，管理實驗室要采取恰當?shù)拇胧?，以保證生物制品標準物質(zhì)在運輸時遵守傳染性物質(zhì)運輸?shù)膰H規(guī)則。

3 我國獸用生物制品標準物質(zhì)制備概況

生物制品標準物質(zhì)在生物制品質(zhì)量控制中起非常重要的作用。隨著我國獸用生物制品事業(yè)的迅猛發(fā)展和獸用生物制品質(zhì)量要求的不斷提高，對獸用生物制品標準物質(zhì)的要求也越來越高。近幾年來，獸用生物制品標準物質(zhì)的研制越來越受到國內(nèi)科學工作者的重視，為提高其質(zhì)量，也逐步與國際接軌，增加了協(xié)作標定、穩(wěn)定性研究、均勻性檢驗等檢驗參數(shù)。但目前國內(nèi)對獸用生物制品標準物質(zhì)的概念和分類還未統(tǒng)一，獸用生物制品標準物質(zhì)制備和標定技術(shù)不統(tǒng)一，所以國內(nèi)獸用生物制品標準物質(zhì)的水平參差不齊。

4 對建立我國獸用生物制品標準物質(zhì)制備程序的建議

WHO生物制品標準物質(zhì)指導(dǎo)原則對國際生物制品標準物質(zhì)的研制工作提供了技術(shù)指導(dǎo)，包括了生物制品標準物質(zhì)的定義、質(zhì)量控制、研制必要性、原材料選擇、檢驗項目等，及時了解該指導(dǎo)原則，對建立我國獸用生物制品標準物質(zhì)的制備程序具有重要意義。應(yīng)根據(jù)WHO的要求，結(jié)合我國實際情況，明確獸用生物制品標準物質(zhì)的概念和分類，確定研制標準物質(zhì)的范圍，統(tǒng)一制備程序，提高制備水平，逐步建立我國獸用生物制品標準物質(zhì)指導(dǎo)原則，完善技術(shù)規(guī)范，從而進一步提高我國獸用生物制品標準物質(zhì)的質(zhì)量。