王 恒，張 宏，張 凱，王 磊，張 康，馬玉俊，李建喜，楊孝樸*，張景艷、*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州 730000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050)

發(fā)酵(Fermentation)是一種從原料或低級(jí)底物中產(chǎn)生高價(jià)值產(chǎn)品的微生物驅(qū)動(dòng)過程。更具體地說，發(fā)酵在微生物酶的作用下分解或轉(zhuǎn)化非所需底物為可共處的成分，通過生產(chǎn)和改進(jìn)具有生物活性的化合物，進(jìn)而改善底物性質(zhì)[1]。傳統(tǒng)中藥發(fā)酵一般多在天然的條件下進(jìn)行的，而現(xiàn)在的中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是在充分吸收了近幾年新興的微生態(tài)學(xué)和生物工程學(xué)的研究成果而逐漸形成的。其先進(jìn)發(fā)酵工藝特點(diǎn)是：以優(yōu)選的有益菌群中的一種或幾種，加入中藥提取液中，再按照現(xiàn)代發(fā)酵工藝制成產(chǎn)品，它是一種含有中藥活性成分、菌體及其代謝產(chǎn)物的全組分發(fā)酵液的新型中藥發(fā)酵加工制劑[2]。中藥發(fā)酵具有可使活性成分大量釋放、產(chǎn)生新的活性成分、降低毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，乳酸菌具有巨大的生物轉(zhuǎn)化功能，菌體本身和其代謝產(chǎn)物也具有很好的益生特性。因此，開發(fā)新型乳酸菌和中藥合生元微生態(tài)制劑十分必要并具有廣闊前景。

實(shí)驗(yàn)利用分離于土雞盲腸的厭氧菌株FGM(GenBank accession number JX435470，專利號(hào)：ZL20120141827.5)為發(fā)酵菌株，在體外建立了發(fā)酵黃芪及多糖提取的技術(shù)工藝，結(jié)果顯示多糖提取率是發(fā)酵前的2.7倍[3、4]。結(jié)合16S rDNA 序列分析、形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定，確定FGM菌株為芽孢桿菌綱，乳桿菌目，鏈球菌科，鏈球菌屬非解乳糖鏈球菌(streptococcus)[5]。目前研究表明，發(fā)酵黃芪具有免疫調(diào)節(jié)[6,7]、保肝[8]、抗氧化[9,10]、抗糖尿病[11]、抗腫瘤[12]及抗疲勞保健[13]等的活性。此外，秦俊杰[14]等發(fā)現(xiàn)，黃芪和黨參發(fā)酵產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)黃羽肉雞生化指標(biāo)的作用，對(duì)機(jī)體生理機(jī)能和促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育方面具有實(shí)踐意義。因此，為進(jìn)一步開發(fā)酵黃芪液和發(fā)酵黃芪多糖產(chǎn)品，對(duì)雞腸道源FGM菌株及黃芪發(fā)酵物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)是非常有必要的。本試驗(yàn)對(duì)FGM菌液和FGM發(fā)酵黃芪液進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)，測(cè)定了小鼠體重，臟器指數(shù)、血常規(guī)以及病理組織學(xué)觀察，旨在明確FGM發(fā)酵黃芪液的安全性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 厭氧培養(yǎng)箱1029型((Thermo Fisher公司)；Sysmex pocH- 100 iv全自動(dòng)三分類血液分析儀(日本希森美康株式會(huì)社)；Leica全自動(dòng)組織切片系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)；奧林巴斯研究級(jí)倒置顯微鏡1X71(日本奧林巴斯株式會(huì)社)?？辔端帷⑸睇}水、10 %中性福爾馬林、石蠟(熔點(diǎn)52～54 ℃、54～56 ℃)、梯度酒精、冬青油、二甲苯、蘇木素、伊紅、中性樹膠等。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，購自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；全價(jià)小鼠顆粒飼料購于蘭州大學(xué)GLP試驗(yàn)樓。

1.3 菌懸液和發(fā)酵液的制備 快速復(fù)蘇凍存的菌株FGM，接種于50 mL的MRS肉湯中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。將復(fù)壯的細(xì)菌按2 %(v/v)的量接種到新的MRS肉湯中，37 ℃厭氧培養(yǎng)。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL，使菌體均勻分散，制成菌懸液備用。

菌株FGM活化傳3代后分別按體積分?jǐn)?shù)3 %(菌量約4 ×108個(gè)/mL)的接菌量接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(已用Na2CO3調(diào)初始pH值至7.4)中，100 r/min、37 ℃厭氧發(fā)酵培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液備用。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組及觀察指標(biāo) 常規(guī)觀察5 d后，將小鼠隨機(jī)分為3組：FGM活菌組、FGM發(fā)酵液組、陰性對(duì)照組。每組10只，雌雄各半。禁食12 h稱重，各組小鼠每次灌胃0.5 mL，連續(xù)3 d，觀察7 d，陰性對(duì)照組同時(shí)給予等量的生理鹽水。依據(jù)表1的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)記錄小鼠的日常采食飲水、死亡情況、被毛色澤、精神狀態(tài)、糞便性狀和精神狀況等表現(xiàn)。在試驗(yàn)第8 d，稱取各組小鼠體重，對(duì)比試驗(yàn)前后小鼠體重變化；摘眼球采血，肝素鈉抗凝全血后，檢測(cè)血液生理指標(biāo)：白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞比容(HCT)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)；剖檢小鼠，觀察各組織臟器的外觀和顏色等特征，對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進(jìn)行稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器重量×100/體重)。

表1 小鼠一般健康體征外觀評(píng)價(jià)Tab 1 Features of general health appearance score

1.5 病理學(xué)檢查 取心臟、肝臟、脾臟、腎臟和小腸等臟器組織，用10 % 的中性福爾馬林溶液浸泡固定臟器，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅(H.E.)染色后，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.5.1 組織切片制備方法

1.5.1.1 取材與固定 用銳利的刀片將臟器組織修為 5×5×3 mm 左右的組織塊。經(jīng)生理鹽水清洗后，用紗布包裹小心放入 10 % 中性福爾馬林中進(jìn)行固定，做好各組標(biāo)記。

1.5.1.2 脫水與透明 取出固定好的組織塊，裝入包埋盒，流水緩慢沖洗3 h，置換出組織中的福爾馬林固定液，然后將包埋盒放入盛有不同濃度乙醇的脫水缸中，進(jìn)行逐級(jí)梯度脫水，脫水步驟依次為：

70% 乙醇Ⅰ60 min→70 % 乙醇Ⅱ 60 min→80 % 乙醇Ⅰ過夜 →80 % 乙醇Ⅱ 60 min→90 %乙醇Ⅰ 60 min→90 % 乙醇Ⅱ 60 min→95 % 乙醇Ⅰ 60 min→95 % 乙醇Ⅱ 60 min→100 % 乙醇Ⅰ 60 min→100 % 乙醇Ⅱ 60 min→100 % 乙醇 Ⅲ 60 min脫水步驟完成后，放入冬青油中過夜，對(duì)組織塊進(jìn)行透明處理，透明過程的具體步驟如下：

冬青油Ⅰ 95 min→冬青油Ⅱ 95 min→冬青油 Ⅲ 過夜

1.5.1.3 浸蠟與包埋 透明操作結(jié)束后，將包埋盒取出，放入融好的石蠟中進(jìn)行浸蠟處理，操作步驟依次為：

石蠟Ⅰ(熔點(diǎn)52～54 ℃)：二甲苯(1∶1) 60 min→石蠟Ⅱ(熔點(diǎn) 54～56 ℃) 60 min→石蠟Ⅲ(熔點(diǎn)54～56 ℃)60 min

將浸好蠟的組織塊從包埋盒中取出，放入包埋槽內(nèi)，快速加入 54～56 ℃的石蠟，進(jìn)行組織包埋。包埋操作要快，以防止組織塊因局部冷卻速度不同、溫度不均而與蠟塊出現(xiàn)分層，影響切片質(zhì)量。

1.5.1.4 修塊與切片 從包埋槽中取出冷卻的蠟塊，簡(jiǎn)單修整，去掉組織周圍多余的石蠟，將蠟塊固定在切片機(jī)的卡槽中，進(jìn)行切片操作，先進(jìn)行 20 μm 粗切，使蠟塊表面平整光滑，然后再調(diào)整切片厚度到 4～6 μm，連續(xù)切片。用小鑷子夾起切出的組織片，小心放入攤片烤片機(jī)的水槽內(nèi)，使蠟片在 45～49 ℃的溫水中緩慢展開，然后用經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片輕輕挑起組織切片，注意組織部分不要重疊，不要有氣泡，將載玻片放在攤片烤片機(jī)的烤片區(qū)，37 ℃烤片過夜。

1.5.1.5 脫蠟 二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ 10 min→100 % 乙醇Ⅰ 5 min→100 %乙醇Ⅱ 5 min→95 %乙醇Ⅰ 5 min→95 %乙醇Ⅱ 5 min→80 %乙醇 5 min→70 %乙醇 5 min→蒸餾水 2 min

1.5.1.6 染色封片鏡檢 染色后用濾紙擦去組織周圍多余二甲苯，在組織上滴一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片(避免氣泡)，37 ℃烤片過夜，最后在顯微鏡下觀察組織病理變化情況。

1.5.2 H.E.染色方法 蘇木素 5 min→蒸餾水沖洗 10 s→分化 (1 %鹽酸乙醇，用 70 %乙醇配制)10 s→自來水返藍(lán) 15～20 min→水溶性伊紅 3 min→70 %乙醇 5 s→80 %乙醇 10s→95 %乙醇Ⅰ 2 min→95 %乙醇Ⅱ 2 min→100 %乙醇Ⅰ 5 min→100 %乙醇Ⅱ 5 min→100 %乙醇Ⅲ 5 min→二甲苯Ⅰ 10 min→二甲苯Ⅱ 10 min→二甲苯Ⅲ 5 min

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)方法 所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17. 0 軟件進(jìn)行方差分析，P<0. 05為差異顯著，P< 0. 01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 死亡情況與一般體征 在試驗(yàn)期間，各組小鼠采食采水正常，兩眼有神，警惕性高，運(yùn)動(dòng)情況和精神狀態(tài)良好，無異常分泌物出現(xiàn)，且沒有死亡病例。對(duì)照表1的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)可知，各組小鼠的一般健康體征外觀等級(jí)相同，均為Ⅰ級(jí)。

2.2 體重變化 如表2所示，各組小鼠體重增長(zhǎng)和波動(dòng)在正常范圍內(nèi)，其中陰性對(duì)照組體增重最高，F(xiàn)GM發(fā)酵液組和活菌組次之。但是通過方差分析可知，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重變化差異不顯著(P> 0.05)。因此，判定FGM菌株及其發(fā)酵黃芪液對(duì)小鼠體重?zé)o影響。

表2 菌懸液和發(fā)酵液對(duì)小鼠體重的影響(x±s，n=10)Tab 2 The effect of bacterial suspension and fermentation broth on the mice body weight

2.3 臟器系數(shù) 剖解后肉眼觀察試驗(yàn)小鼠的臟器，發(fā)現(xiàn)各組小鼠主要器官色澤正常，位置、形狀與體積均正常，主要器官之間無腫大、粘連、包塊等病理變化，胃、腸未見潰瘍和出血點(diǎn)。如表3所示，各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及胸腺的臟器系數(shù)，與陰性對(duì)照組相比差異均不顯著(P> 0.05)，且均在正常范圍內(nèi)。此外，F(xiàn)GM活菌及發(fā)酵液組小鼠免疫器官(脾臟和胸腺)的臟器系數(shù)高于陰性對(duì)照組。結(jié)果提示，F(xiàn)GM菌株及其發(fā)酵黃芪液對(duì)小鼠組織無不良影響。

表3 菌懸液和發(fā)酵液對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響(x±s，n=10)Tab 3 The effects of bacterial suspension and fermentation broth on the organ index of mice

2.4 血液學(xué)指標(biāo) 外周血紅白細(xì)胞、紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)是反映小鼠免疫系統(tǒng)和炎癥損傷的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，F(xiàn)GM菌懸液組和FGM發(fā)酵液組小鼠血液中RBC、WBC、HGB、HCT、MCHC數(shù)值有一定波動(dòng)，但與陰性對(duì)照組小鼠相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。結(jié)果提示，F(xiàn)GM菌株及其發(fā)酵黃芪液對(duì)小鼠血液主要成分無不良影響。

表4 菌懸液和發(fā)酵液對(duì)小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(x ± s，n=10)Tab 4 The effects of bacterial suspension and fermentation broth on the haematological index of mice

2.5 病理變化 文中圖1、圖2、圖3分別為陰性對(duì)照組、FGM活菌組和FGM發(fā)酵液組的組織切片鏡檢結(jié)果。由圖可知：各試驗(yàn)組小鼠心臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，心肌纖維排列整齊，心肌纖維細(xì)胞分布均勻，肌纖維染色均勻，未發(fā)現(xiàn)異常病變；肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈梁索狀，以中央靜脈為中心放射狀整齊排列，無充血水腫和變性壞死現(xiàn)象；腎臟組織正常，腎小體及腎小管結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核分布均勻，無水腫和出血現(xiàn)象。腸道絨毛結(jié)構(gòu)完整，固有層和粘膜上皮結(jié)構(gòu)正常，中央脈管束結(jié)構(gòu)清晰，鏡下無可見病理變化。

a：心臟；b：肝臟；c：小腸；d：腎臟。a: Heart; b: Liver; c: Small intestine;d: Kidney.圖1 陰性對(duì)照組主要臟器病理切片(H.E×400)Fig 1 Pathological sections of major organs on NG

a：心臟；b：肝臟；c：小腸；d：腎臟。a: Heart; b: Liver; c: Small intestine;d: Kidney.圖2 FGM活菌組主要臟器病理切片(H.E×400)Fig 2 Pathological sections of major organs on FGM

a：心臟；b：肝臟；c：小腸；d：腎臟。a: Heart; b: Liver; c: Small intestine;d: Kidney.圖3 FGM發(fā)酵液組主要臟器病理切片(H.E×400)Fig 3 Pathological sections of major organs on FAL

3 討論與結(jié)論

微生物轉(zhuǎn)化型中獸藥研發(fā)和應(yīng)用的首要前提和必備條件應(yīng)是安全性好、無毒副作用。當(dāng)然，通過微生物二次分解轉(zhuǎn)化后的發(fā)酵中藥也應(yīng)具備優(yōu)良的生物學(xué)活性和功效。由于此類產(chǎn)品中含有活的細(xì)菌菌株，因此在對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的同時(shí)，也應(yīng)該考慮發(fā)酵菌株的致病性。益生性菌株的安全性是評(píng)價(jià)菌株生物學(xué)特性的關(guān)鍵，可以通過臟器指數(shù)、半數(shù)致死量、體重變化、菌株易位等試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)[15,16]。王葦[17]等對(duì)篩選出的優(yōu)良芽孢桿菌進(jìn)行不同劑量菌液分別以不同方式感染小鼠，觀察各臟器病理變化和測(cè)定主要臟器指數(shù)，結(jié)果顯示小鼠臟器無病變，臟器指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。目前，對(duì)植物乳桿菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等獸用益生菌的安全性研究已有報(bào)道[18-20]。

非解乳糖鏈球菌最早由Farrow[21]等從豬腸道和雞糞便中分離發(fā)現(xiàn)，明確該類細(xì)菌為無鞭毛、無溶血性、成對(duì)或鏈狀排列、兼性厭氧的乳白色革蘭氏陽性球菌。隨后，它被證明是雞、豬、狗、鴨、鴿子和魚等動(dòng)物腸道中的主要可培養(yǎng)細(xì)菌[22-23]，但是對(duì)非解乳糖鏈球菌的安全性評(píng)價(jià)尚未見報(bào)道。利用土雞盲腸源非解乳糖鏈球菌FGM菌株制備的發(fā)酵型黃芪既保留了FGM菌株的活性，同時(shí)還提升了黃芪的生物學(xué)活性。因此，該產(chǎn)品在改善畜禽早期腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高抗病性方面具有很好的應(yīng)用前景。有鑒于此，本研究從發(fā)酵菌株和發(fā)酵產(chǎn)物2個(gè)方面入手，通過比較FGM活菌組、FGM發(fā)酵黃芪液組小鼠與陰性對(duì)照組小鼠的體增重、血液生理指標(biāo)和臟器指數(shù)的變化，并結(jié)合剖檢和病理組織切片觀察，明確了FGM發(fā)酵黃芪液及其發(fā)酵菌株對(duì)小鼠生長(zhǎng)情況、血液成分及臟器均無不良影響，安全無毒。本研究為發(fā)酵黃芪的開發(fā)和應(yīng)用提供了臨床前毒理學(xué)背景信息，也填補(bǔ)了有關(guān)非解乳糖鏈球菌的安全性信息，后續(xù)研究將依照獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)進(jìn)一步開展FGM發(fā)酵黃芪液的亞慢性毒性試驗(yàn)，完善該產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)。

FGM發(fā)酵黃芪液及其發(fā)酵菌株灌服小鼠，對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況和主要臟器均無不良影響和毒副作用，表明非解乳糖鏈球菌FGM對(duì)小鼠無治病性、可用為發(fā)酵菌株；FGM發(fā)酵黃芪液安全、可飼喂。