范建華，趙華軒，李尚民，蔣一秀，孫常法，姚勤光，竇新紅*

(1.江蘇省家禽研究所，江蘇揚州 225003；2.江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州 225003；3.江蘇康世源藥液有限公司，江蘇新沂 221400)

在畜禽養(yǎng)殖中，垂直傳播疾病一直困擾著我國畜牧業(yè)健康發(fā)展[1]。垂直傳播疾病，除了蛋胚源媒介外，另外一個重要環(huán)節(jié)就是公畜禽通過配種(包括人工授精和自然交配)，將精液含有的病原微生物傳給母體，其受孕的過程可能就是病原傳播的過程。在生產(chǎn)實踐中，曾發(fā)生過多種垂直傳播疾病，如豬藍(lán)耳病、豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、禽流感、禽白血病、雞傳染性貧血等[2,3]，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還會通過種代擴(kuò)繁傳播至下一代[4]，造成更大范圍的感染。

目前解決種畜禽精液中帶菌或帶毒問題的最常見方法是，在精液稀釋過程中適量添加抗生素進(jìn)行消毒。但該方法對病毒的作用微乎其微，并存在因長期應(yīng)用而導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性問題，而且還對精液精子活力存在極大的傷害[5-7]。

為此，本研究對新創(chuàng)制開發(fā)的一種中藥精液消毒劑進(jìn)行了體外抑菌殺毒和急性毒性、刺激性，以及臨床應(yīng)用等安全性評價實驗，以期為今后進(jìn)一步研制一種安全高效的中藥精液消毒劑產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 試驗菌(毒)種 實驗選用的細(xì)菌禽巴氏桿菌C48-1 株、雞白痢標(biāo)準(zhǔn)株YD2 株、大腸桿菌C15003 株和金黃色葡萄球菌YD-1 株均為本實驗室保存菌株；選用的新城疫病毒F48E8為揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院惠贈。

1.2 試驗動物 實驗選用的BABC小鼠、新西蘭大白兔和雞胚等均為市購。

1.3 主要儀器設(shè)備 主要儀器設(shè)備包括超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、高效液相色譜儀、電子顯微鏡、中藥混懸液均質(zhì)機(jī)、實驗動物飼養(yǎng)籠具和小型孵化器等。

2 方 法

2.1 中藥精液消毒劑的制備 按成分重量比，取板藍(lán)根、苦楝、地榆、大青葉和蘆薈提取物各1.5%、果糖3.0%、甘油4.0%、檸檬酸鈉2.5%、維生素C 0.3%、余量為去離子水混合，并用檸檬酸鈉調(diào)至PH值7.5±0.2，在37℃、轉(zhuǎn)速為20～25 轉(zhuǎn)/分的條件下低速攪拌30 分鐘混勻，經(jīng)過濾除菌后澄清、透明溶液即為本實驗用中藥消毒劑。

2.2 對病原微生物的殺滅試驗

2.2.1 對4種有害菌的體外抑菌試驗 采用打洞法[8]開展受試消毒劑對4種致病菌的藥敏試驗，根據(jù)抑菌圈直徑>20 mm為極敏，15～20 mm為高敏,10～14 mm為中敏，<10 mm為低敏來判定受試藥物敏感度高低[9]；將受試消毒劑用生理鹽水按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀釋，測定其對4種致病菌的最小抑菌濃度。

2.2.2 對雞新城疫病毒(NDV)的殺滅試驗

2.2.2.1 雞新城疫病毒(NDV)的定性殺滅試驗 采用雞胚感染法[10]，將受試消毒劑用去離子水稀釋成1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000的梯度濃度下各2.5 mL，在室溫條件下與2×105EID502.5 mL的新城疫病毒分別感作5、15和30 min，接種10 日齡的雞胚，24 h后觀察雞胚死亡情況。

2.2.2.2 雞新城疫病毒(NDV)的定量殺滅試驗 將新城疫病毒液稀釋成2×105EID502.5 mL，分別加入三個不同濃度的消毒劑1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000各2.5 mL，以PBS作為對照組。充分搖勻，置室溫5 min，吸取混合液1 mL加入9 mL硫代硫酸鈉中和劑，作用10 min后，測定各組病毒滴度EID50值。EID50值參照Reed-Muench方法[11]計算。

2.3 安全性評價試驗

2.3.1 急性毒性試驗 選擇體重約20 g的BABC小鼠雌雄各10 只。取原藥液10 mL加去離子水20 ml稀釋作為供試液，按0.1 mL/10 g.BW的劑量一次性經(jīng)口灌胃，最大限度灌胃劑量設(shè)計5000 mg/kg.BW(按體積重量比折算，5000 mg為灌胃液中含原藥液總重量)，連續(xù)2 周觀察小鼠的采食、飲水及精神狀態(tài)情況，計算體重變化、中毒死亡只數(shù)。

2.3.2 刺激性試驗

2.3.2.1 皮膚刺激性試驗 選擇健康無眼部疾病，體重約2.3 kg的新西蘭大白兔3 只。試驗前24 h，將兔子背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛范圍3 cm×3 cm，第二天在左側(cè)去毛部位劃出2.5 cm×2.5 cm試驗區(qū)，在其上將受試消毒劑原液0.5 mL均勻涂布，并覆蓋2～4層同樣大小的紗布和一層稍大的玻璃紙，再用無刺激的膠布固定，使受試消毒劑與皮膚直接接觸4 h。右側(cè)作為對照。試驗結(jié)束后除去覆蓋物，并用溫水洗凈。分別記錄除去覆蓋物后的2 周內(nèi)的皮膚刺激反應(yīng)。

2.3.2.2 眼睛刺激性試驗 選擇健康無眼部疾病，體重約2.3 kg的新西蘭大白兔3 只。將動物左側(cè)眼瞼輕輕分開，吸取0.1 mL受試消毒劑原液滴入眼結(jié)膜囊內(nèi)，右側(cè)眼滴入等量的生理鹽水作為對照。滴眼后將上下眼閉合30 s，再用生理鹽水沖洗，除去受試藥品。分別于滴眼后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d、14 d和21 d，觀察兔子角膜、虹膜和結(jié)膜刺激反應(yīng)。

2.3.3 精子活力影響試驗

2.3.3.1 常溫保存條件下對精子生存指數(shù)影響 將新鮮采集的種公雞精液，在37 ℃水浴條件下，按照1∶2分別加入原液受試消毒劑、10倍原液稀釋受試消毒劑和100倍原液稀釋受試消毒劑，以及生理鹽水對照，然后在20℃條件下，每隔2 h觀察精子的存活情況，最終統(tǒng)計精子生存指數(shù)。

2.3.3.2 凍融條件下對精子存活率影響 將活力不低于0.7，密度在0.8～1.0×108/ml精子，按照有關(guān)參考文獻(xiàn)方法，分別在原液受試消毒劑、10倍原液稀釋受試消毒劑和100倍原液稀釋受試消毒劑中冷凍再解凍，并設(shè)生理鹽水作為對照，觀察凍后精子的存活率。

2.3.4 對種公雞精液消毒后的次代孵化率和出雛率影響試驗 將新鮮采集的種公雞精液，在37℃水浴條件下，按照1∶2分別加入10倍稀釋的受試消毒劑和12%的甘油稀釋，并設(shè)生理鹽水對照。然后按正常生產(chǎn)方式人工授精和收集種蛋，進(jìn)行孵化，分別記錄種蛋受精率和孵化率。取兩次測定結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 對病原微生物的殺滅效果

3.1.1 對4種雞有害菌的殺滅效果 由藥敏試驗結(jié)果可知，該消毒劑對大腸桿菌的抑菌圈直徑平均為18 mm，屬于高度敏感，對沙門氏菌、禽巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑范圍為11～12 mm，均為中度敏感；稀釋16倍后，對禽巴氏桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度為62.5 mg/mL，稀釋32倍后，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為31.3 mg/mL。具體結(jié)果見表1和表2。

3.1.2 對雞新城疫病毒(NDV)的殺滅效果 對NDV的定性殺滅結(jié)果表明，受試消毒劑按1∶400及以上濃度稀釋，最短作用時間5 min，即對NDV具有良好的殺滅效果，病毒殺滅率為100%，達(dá)到國內(nèi)規(guī)定的消毒劑消毒標(biāo)準(zhǔn)。具體結(jié)果見表3。

對NDV的定量殺滅結(jié)果表明，受試消毒劑按1∶400及以上濃度稀釋，雞胚無死亡，病毒滅活率為100%。具體結(jié)果見表4。

表1 中藥消毒劑藥敏試驗測定結(jié)果Tab 1 Results of drug sensitivity test of traditional Chinese medicine disinfectant

表2 中藥消毒劑最小抑菌濃度Tab 2 MIC of traditional Chinese medicine disinfectant

表3 中藥消毒劑對NDV的定性殺滅結(jié)果Tab 3 Qualitative killing results of traditional Chinese medicine disinfectant to NDV

注：*為陽性雞胚數(shù)/試驗雞胚數(shù)

Note: * Positive Embryo Count / Test Embryo Count

表4 中藥消毒劑對NDV的定量殺滅結(jié)果Tab 4 Qualified killing results of traditional Chinese medicine disinfectant to NDV

3.2 安全性評價

3.2.1 急性毒性試驗結(jié)果 由表5可知，17 d觀察期內(nèi)，20只受試小鼠體重逐漸增加，未見任何中毒體征和死亡。受試消毒劑經(jīng)口半數(shù)致死量LD50>5000 mg/kg。根據(jù)急性毒性評價規(guī)定，該消毒劑為無毒級。

表5 小鼠急性毒性試驗結(jié)果Tab 5 Results of acute toxicity test in mice

3.2.2 皮膚和眼睛刺激性試驗結(jié)果 表6試驗結(jié)果表明，受試消毒劑連續(xù)對新西蘭大白兔皮膚涂抹14 d，試驗期間未見紅斑和水腫等異常反應(yīng)，刺激指數(shù)為0，對皮膚無刺激。表7試驗結(jié)果表明，給藥期間，受試動物眼均未出現(xiàn)角膜和虹膜損害以及結(jié)膜水腫或充血現(xiàn)象，眼刺激平均評分為0，也未見全身中毒，對眼睛無刺激。

表6 大白兔的皮膚刺激反應(yīng)評分Tab 6 Skin irritation response scores of white rabbits

表7 大白兔的眼部刺激反應(yīng)評分Tab 7 Eye irritation response scores of white rabbits

3.2.3 對精子活力的影響 由表8可知，常溫保存下，精子中加入受試消毒劑組生存指數(shù)均低于生理鹽水對照組，原液組和100倍稀釋組差異顯著(P<0.05)，但10倍稀釋組差異不顯著(P>0.05)；3個梯度受試消毒劑組間，10倍稀釋組要顯著高于其它兩組(P<0.05)。由表9可知，在冷凍條件下，受試消毒劑組精子的存活率均顯著高于對照組(P<0.05)，且10倍原液稀釋受試消毒劑組差異極顯著(P<0.01)。

表8 種公雞精液中精子的中生存指數(shù)Tab 8 Median survival index of spermatozoa in semen of breeder cocks

注：肩頭雙字母中有一個不同，均表示差異顯著(P<0.05)。

Note: There was one difference of double letters in shoulder， which indicated significant difference (P< 0.05).

表9 中藥消毒劑對種公雞精液中精子冷凍保護(hù)效果Tab 9 Cryopreservation effect of traditional Chinese medicine disinfectant to breeder cocks sperm

注：肩頭字母不同，表示差異顯著(P<0.05)。

Note: The difference of shoulder letters is significant (P< 0.05).

3.2.4 對雞次代孵化和出雛率的影響 中藥精液消毒劑與精液作用后，對蛋雞受精率和孵化率影響結(jié)果(表10)表明，3個組別對蛋雞受精率和孵化率影響差異不顯著(P>0.05)，但受試消毒劑組和甘油組效果略佳。

4 討論與結(jié)論

常見的畜禽消毒劑(如抗生素和各種化學(xué)試劑)雖然能夠有效抑制或殺滅病原微生物，但都因為安全性問題很難在種畜禽精液中應(yīng)用[12]。本試驗研發(fā)的中藥消毒劑選用的板藍(lán)根、苦楝、地榆、大青葉、蘆薈等中草藥提取物，具有清熱解毒、殺菌消炎等實際功效，能夠殺滅多種病毒和有害菌[13]；果糖能夠為精子提供營養(yǎng)和能量[14]；甘油是常用的抗凍保護(hù)劑，能夠防止精原細(xì)胞脫水，延遲精液保存時間；檸檬酸鈉能調(diào)節(jié)精液的pH值，起緩沖保護(hù)和平衡電解質(zhì)的作用；維生素C可以抗氧化并為精子提供營養(yǎng)。同時，各成分間功效相互增益，相互協(xié)同，對精液有較好的消毒效果。

表10 中藥精液消毒劑對蛋雞受精率和孵化率的影響Tab 10 Effect of traditional Chinese medicine semen disinfectant on fertilization rate and hatching rate of laying hens

通過藥效學(xué)試驗可知該中藥消毒劑對大腸桿菌、沙門氏菌、禽巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌有普適性，其中對大 腸桿菌殺滅效果最強(qiáng)。稀釋400倍的中藥消毒劑作用5 min，即對NDV具有良好的殺滅效果，達(dá)到國內(nèi)規(guī)定的病毒殺滅率標(biāo)準(zhǔn)[15]。隨著稀釋倍數(shù)增加，中藥消毒劑的殺滅效果降低，作用時間延長，殺滅效果增強(qiáng)，因此在實際使用時要按照具體情況，靈活調(diào)整消毒劑的濃度和作用時間，以達(dá)到徹底殺滅致病菌和病毒的目的。

通過急性經(jīng)口試驗、皮膚和眼睛刺激試驗可知，該消毒劑安全無刺激性。而申玉璽等[16]報道發(fā)現(xiàn)5種低毒化學(xué)消毒劑在低濃度下就可以有效滅活新城疫病毒，雖然安全性相對較高，但仍需另加化學(xué)緩沖劑中和殘留消毒劑，以減少和試驗細(xì)胞的損傷。

此外，本中藥消毒劑對常溫下種雞精液中精子的生存指數(shù)影響不大，且能顯著提高冷凍條件下精子的存活率，同時還提高了蛋雞受精率和次代孵化率，可能均與該中藥消毒劑對精液中病原微生物的殺滅作用有關(guān)。其中10倍稀釋組要明顯優(yōu)于原液組和100倍稀釋組。筆者分析，消毒劑濃度偏高使得藥液中鞣酸、堿等有效成分也偏高，因而對精液精子的刺激傷害作用也增大，而消毒劑濃度降低，其中果糖和維生素C等精子有效保護(hù)因子也相對減少。因此，該消毒劑在臨床應(yīng)用時，要想既能達(dá)到殺滅精液中病原微生物的效果，又要最大限度地減少精子的損害，必須選擇一個適中稀釋消毒濃度。

本試驗研發(fā)的中藥消毒劑原液在400倍及以上濃度稀釋應(yīng)用，可對大腸桿菌等4種常見病原菌有較好的消殺效果，在5 min內(nèi)對新城疫病毒有100%殺滅率；經(jīng)口灌胃急性毒性試驗和粘膜染毒刺激性試驗表明該消毒劑安全無毒無刺激；該消毒劑對種公雞精液精子刺激性影響不大，且對凍融條件下精子有較好的保護(hù)效果；通過人工授精和孵化等試驗證明，該消毒劑對提高蛋雞受精率和次代孵化率有顯明效果。

綜上研究，建議對種畜禽精液消毒的臨床最佳方法為：在人工輸精前，將該中藥消毒劑用去離子水按10倍量稀釋后，按1∶2與采集的精液體積稀釋，并互作至少5 min。