禽腺病毒(fowl adenovirus)感染引起的疾病最早于1987 年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)被發(fā)現(xiàn),因此也稱作“安卡拉病”,之后在中國、韓國、日本、印度、美國及加拿大等不同國家及地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。FAdV-4 可通過呼吸道等途徑水平傳播,也可以通過雞胚垂直傳播,給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。同時,該病的感染譜較為廣泛,除了可以感染肉雞、肉種雞及蛋雞外,還可以感染鴨和鵝,對我國家禽乃至水禽的綠色健康養(yǎng)殖構成巨大威脅。病毒感染的第一步是吸附靶細胞,決定FAdV-4 進入細胞的重要受體分子仍未完全明確。
中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病創(chuàng)新團隊近期發(fā)表在《Emerging Microbes & Infections》雜志的一項研究對于FAdV-4 受體進行了一系列篩選與鑒定。該團隊發(fā)現(xiàn)CAR 分子(coxsackie and adenovirus receptor)可以促進病毒進入靶細胞肝細胞,并且可以使FAdV-4 獲得吸附非易感細胞的能力。
該團隊以FAdV-4 HLJFAd15 株及雞肝癌細胞系(LMH 細胞)為主要研究對象,首先篩選了介導腺病毒入侵的病毒蛋白,將帶Fc 標簽的腺病毒的刺突蛋白fibre1 和fibre2 進行可溶性表達,將這兩種蛋白分別結合LMH 細胞后加入FAdV-4,檢測病毒進入情況,可見fibre1 蛋白預處理的LMH 細胞可以有效封閉病毒進入細胞,而fibre2 則無效。抗體封閉實驗也得到了同樣結果。說明fibre1 介導FAdV-4 進入細胞。
接下來利用質(zhì)譜實驗篩選與fibre1 蛋白互作的LMH 細胞膜蛋白,篩選CAR 分子作為候選受體分子。為了進一步確認CAR 蛋白在病毒復制過程中的作用,通過siRNA干擾實驗及共聚焦實驗進一步確定CAR 促進病毒復制。將CAR siRNA 轉染至LMH 細胞后接毒,可見CAR干擾后顯著抑制FAdV-4復制。
為了探索CAR 影響病毒復制的具體過程,將CAR 在LMH 細胞過表達后進行病毒吸附實驗,共聚焦結果可見CAR 過表達組部分病毒進入細胞,并與CAR 共定位,而對照組病毒則全部定位在細胞膜上,說明CAR 影響病毒入侵過程。
為了進一步確認CAR 在病毒入侵過程的作用,進行抗體封閉及蛋白封閉實驗,結果可見,不同濃度的CAR 可溶性蛋白及抗CAR 抗體均可以抑制FAdV-4 感染LMH 細胞,該現(xiàn)象在一定范圍內(nèi)具有濃度依賴性。接下來通過受體重建實驗進一步驗證,將CAR 過表達在FAdV-4 非允許細胞293T 或PK-15 細胞上,然后感染FAdV-4,共聚焦實驗結果可見CAR 過表達組病毒與CAR 共定位在非易感細胞的細胞質(zhì)中,而對照組則無病毒感染。qPCR 結果表明,CAR 過表達組較對照組病毒滴度顯著提高。
2015 年,血清4 型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,F(xiàn)AdV-4)在中國多個省份暴發(fā)并廣泛流行,該病毒表現(xiàn)出突發(fā)性、高感染率(30%~100%)和高死亡率(最高可達100%)。FAdV-4 感染可導致家禽急性死亡,剖檢可見典型的心包積液及包涵體肝炎癥狀,給養(yǎng)禽業(yè)造成新的威脅。該研究證實了CAR 是FAdV-4 的功能性受體,表明該分子在病毒復制中的重要作用,為闡明FAdV-4 的致病機制,以及疫苗、藥物靶點的篩選提供了重要的理論依據(jù)。