周洪英 孫 波 羅 帷 胡 柏 吳洪麗*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，武漢 430064；2.武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，武漢 430205)

桑黃為名貴傳統(tǒng)中藥，在中國(guó)、韓國(guó)等國(guó)家廣受關(guān)注[1-2]。桑黃是一類桑黃屬真菌的統(tǒng)稱，桑黃屬是最重要的藥用真菌屬之一，現(xiàn)有13個(gè)種，屬于銹革孔菌目，寄生于赤楊皮、胡桃、忍冬、桑屬、楊樹、櫟屬、紫丁香屬植物和錦帶花上，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降血糖、護(hù)肝等效果[2]。由于桑黃種及其宿主植物種的多樣性，且桑黃子實(shí)體形態(tài)學(xué)特征與相似物種的差異不明確，加上桑黃本身極高的價(jià)值和關(guān)注度，將桑黃與其形似物種區(qū)分開來顯得十分重要。

形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定相結(jié)合，能有效進(jìn)行微生物鑒定分類。本研究采集到一株形似桑黃野生真菌(LH02)，對(duì)其子實(shí)體進(jìn)行組織分離得到純培養(yǎng)分離株，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定與分類。

1 材料方法

1.1 供試菌株及聚類用參考菌株

LH02，湖北省武漢市洪山區(qū)南湖邊柳樹上采集；

SH01，本室分離保存，經(jīng)鑒定為桑樹桑黃(Sanghuangporussanghuang)；

Sanghuangporusvaniniivoucher Dai8236,GenBank: MF772812.1

SanghuangporuspilatiiBRNM 771989, GenBank: KT428764.1

SanghuangporusquercicolavoucherDai 13947, GenBank: KY328309.1

SanghuangporussanghuangvoucherCui 14419, GenBank: MF772789.1

SanghuangporuslonicericolaDai8376, GenBank: JQ860308.1

SanghuangporusligneusMG13, GenBank: KR073082.1

SanghuangporusbaumiiDai16900, GenBank: MF772785.1

SanghuangporuszonatusCui8327, GenBank: JX069837.1

SanghuangporusalpinusvoucherCui124 85, GenBank: MF772781.1

Sanghuangporusweigelaevoucher Dai16 077, GenBank: MF772794.1

Sanghuangporuslonicerinusvoucher Dai 17095, GenBank: MF772787.1

Sanghuangporusmicrocystideusvoucher O 915609, GenBank: KP030787.1

SanghuangporusweirianusstrainCBS 618.89, GenBank: AY558654.1

Tropicoporusrudisvoucher O 915617, GenBank: MH101016.1

Tropicoporuslinteusvoucher JV 0904/64, GenBank: JX467701.1

Tropicoporusguaracastensisvoucher O 19228, GenBank: KP030794.1

TropicoporuspseudolinteusJV 0402/35-K, GenBank: KC778781.1

TropicoporussideroxylicolaJV 0409/30-J, GenBank: KC778782.1

Inonotusgriseusvoucher Dai 13436, GenBank: KX674583.1

Inonotushenanensisvoucher Dai 13157, GenBank: KX674581.1

Funaliatrogiiisolate XSD-37, GenBank: EU273516.1

Coriolopsistrogiistrain IFP 00751, GenBank: MG779615.1

Fomestruncatosporusisolate NW514, GenBank: EU622258.1

Alternariabokuraistrain 32, GenBank: FJ467353.1

1.2 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯洗凈去皮挖芽，切成玉米粒大小顆粒，稱取200 g加水1 000 mL熬煮，水沸后20～25 min，雙層紗布過濾取濾汁定容至1 000 mL，加入葡萄糖20 g，pH自然。

PDA固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉。

1.3 菌株的分離培養(yǎng)

無菌條件下，用接種針取子實(shí)體內(nèi)部組織，轉(zhuǎn)至PDA平板中28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察平板上的菌落形態(tài)，再取少量菌絲接種于PDA液體培養(yǎng)基，搖床28 ℃，120 r/min培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌絲球。

1.4 DNA抽提，PCR和測(cè)序

取液體培養(yǎng)菌絲球液氮研磨，CTAB法抽提總DNA[3]，通用引物ITS5(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)、ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)用于擴(kuò)增ITS rDNA及擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。PCR在30 μL含2×Es Taq MasterMix的反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系及PCR條件見產(chǎn)品說明書。PCR產(chǎn)物交測(cè)序公司測(cè)序。

1.5 序列比對(duì)和聚類分析

測(cè)序結(jié)果使用Seqman軟件拼接矯正不一致堿基，所得ITS序列與NCBI Nucleotide數(shù)據(jù)庫比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果中序列一致性最高的菌株、SH01、桑黃屬內(nèi)13個(gè)種及其近緣種屬菌株[2]ITS序列作為參考，用CLUSTAL W軟件[4]比對(duì)LH02及參考菌株序列，MEGA軟件[5]鄰接法(neighbor-joining，NJ，bootstrap 1000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

野生LH02寄生于柳樹上，桑樹桑黃SH01寄生于桑樹上。LH02子實(shí)體與野生桑黃子實(shí)體形態(tài)類似(圖1A-C)。

A-野生LH02子實(shí)體形態(tài)，寄生于柳樹上；B/C-野生SH01子實(shí)體形態(tài)，寄生于桑樹上；D-LH02菌落為乳白色，菌絲體茂密粗壯，生長(zhǎng)速度較快；E-SH01菌落為淡黃色，菌絲體稀釋纖細(xì)，生長(zhǎng)速度一般。

圖1 LH02與SH01形態(tài)比較

LH02菌蓋表面為黃棕色至棕色，多年生老熟子實(shí)體菌蓋則為棕褐色，無菌柄，菌蓋木質(zhì)化，還具有反復(fù)生長(zhǎng)停頓形成的年輪狀結(jié)構(gòu)，呈扇形、馬蹄形等。

LH02、SH01經(jīng)過瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)后觀察比較菌落，菌落形態(tài)及特性差異明顯(圖1D-E)。LH02菌落呈圓形、微凸光滑、濕潤(rùn)、顏色為乳白色，菌絲體茂密粗壯，生長(zhǎng)速度較快；SH01菌落呈圓形、微凸光滑、濕潤(rùn)、顏色為淡黃色，菌絲體稀疏纖細(xì)，生長(zhǎng)速度較慢。

2.2 ITS序列分析

LH02的ITS測(cè)序結(jié)果提交NCBI GENBANK注冊(cè)，索取號(hào)MN726442。將LH02及SH01等參考菌株的ITS序列聚類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)，結(jié)果表明LH02與SH01等桑黃屬及其近緣真菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與C. trogii IFP 00751親緣關(guān)系最近，是革孔菌屬(Coriolopsis)真菌。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的LH02及桑黃等參考菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

桑黃的藥用價(jià)值最先在中醫(yī)典籍中得到肯定，《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等多個(gè)中藥典籍中均有記載。近代研究顯示，桑黃對(duì)腫瘤抑制效果顯著，已成為國(guó)際公認(rèn)的最有效的抗癌真菌，其突出的抗腫瘤功效在日韓等國(guó)家備受關(guān)注，同時(shí)還有抗氧化、抗炎、降血糖、護(hù)肝等效果[6-7]。然而在掠奪性開采下，野生資源日漸枯竭，人工馴化成功的品種和產(chǎn)量又極其有限，加之桑黃本身又極具價(jià)值，于是大量桑黃的形似真菌、近緣真菌涌入市場(chǎng)，功效參差不齊，為從業(yè)人員和消費(fèi)者帶來困擾，也極大限制了桑黃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。區(qū)分桑黃及其形似真菌、近緣真菌，成為桑黃屬真菌資源開發(fā)利用中急需解決的一個(gè)問題。

多孔菌科真菌子實(shí)體缺乏明顯的組織器官分化，顏色、大小等性狀易受環(huán)境、生長(zhǎng)時(shí)間等因素影響，依據(jù)子實(shí)體形態(tài)進(jìn)行分類鑒定有很大不確定性。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下菌絲體和菌落形態(tài)相對(duì)較穩(wěn)定，ITS、28S rDNA等保守基因序列更為穩(wěn)定可靠。本研究結(jié)合子實(shí)體外形、菌絲體性狀、菌落形態(tài)比較及ITS序列聚類分析，將柳樹上寄生的一株野生多孔菌與桑黃屬真菌區(qū)分開來，該方法可為桑黃屬菌株的鑒偽工作提供參考。

此外，很多桑黃屬之外的多孔菌也有抗癌活性[8]，有深入研究的價(jià)值，需投入更多科研力量揭示這類真菌的功能和活性。