劉 元 ，劉 淼，阮 元，張少寧，王旭光，文春南，麻兵繼，*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材系，河南 鄭州 450002；2.河南白云牧港生物有限公司，河南 登封 452470）

植物內(nèi)生真菌在長時間的進化過程中和宿主植物建立了共生關(guān)系，不僅能獨立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，而且還能參與宿主植物的代謝過程，對植物的生長發(fā)育、抗病抗逆、有效成分的產(chǎn)生和積累起到促進作用［1］。山藥為薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的根莖［2］。古河南懷慶府地區(qū)（今博愛、武陟、溫縣）所產(chǎn)山藥最佳，故謂之“懷山藥”，為著名的四大懷藥之一［3］，也是我國傳統(tǒng)的藥食同源品種之一。文獻報道懷山藥中含有薯蕷皂苷、尿囊素、膽堿、糖蛋白、自由氨基酸、山藥堿、山藥多糖等多種成分［4-5］，具有健脾益胃、生津益肺、補腎澀精等功效，素有“懷參”之譽。

目前，對懷山藥內(nèi)生真菌的研究較少。本課題組前期采用高通量測序技術(shù)，測定了懷山藥根、莖中主要內(nèi)生真菌分布。其中優(yōu)勢內(nèi)生真菌有鏈格孢屬（根17.1%、莖33.2%），葡萄孢盤菌屬（根34.1%、莖6.3%），毛球殼屬（根20.0%、莖0.3%）［6］。本課題組通過傳統(tǒng)的分離方式從懷山藥的根、莖中純化獲得了38 株可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌［7］。文獻報道植物內(nèi)生真菌對宿主植物具有促生長作用［8］，3-吲哚乙酸是人們最早發(fā)現(xiàn)的植物生長激素，可調(diào)控植物細(xì)胞的分裂、伸長、分化、根原基發(fā)生及胚的形成過程［9］。為深入研究內(nèi)生真菌與懷山藥的共生關(guān)系，本實驗對前期分離得到的38 株懷山藥內(nèi)生真菌進行產(chǎn)生長激素3-吲哚乙酸的篩選，并以PDB（馬鈴薯葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基）、SDB（沙氏液體培養(yǎng)基）、SNB（合成低營養(yǎng)液體培養(yǎng)基）、MB（麥芽浸汁液體培養(yǎng)基）4 種不同培養(yǎng)基考察陽性菌株分泌3-吲哚乙酸的能力，進而借助HPLC 測定其最大分泌量，旨在發(fā)現(xiàn)對懷山藥促生作用明顯的菌株。

1 材料

1.1 供試菌株 懷山藥的根、莖中分離得到的38 株內(nèi)生真菌。

1.2 供試培養(yǎng)基 PDB 培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。SDB培養(yǎng)基，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。SNB 培養(yǎng)基，KH2PO41 g，KNO31 g，MgSO40.5 g，蔗糖0.2 g，葡萄糖0.2 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。MB 培養(yǎng)基，麥芽浸膏25 g，蒸餾水1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器 LDZF-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；QHZ-98 A 全溫震蕩搖床（太倉市華美生化儀器廠）；GXZ 型多段編程智能光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州予華儀器制造有限公司）；Waters 1525 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；分析天平（萬分之一，上海菁海儀器有限公司）。

1.4 試劑 Salkowski 試劑，稱取FeCl312 g，溶于500 mL蒸餾水中，然后緩慢加入430 mL 98% H2SO4，冷卻后定容至1 L，配置成標(biāo)準(zhǔn)比色液（測定范圍為 0.3～20 mg/L）［10］。乙酸乙酯（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；乙腈（一級色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 篩選懷山藥內(nèi)生真菌分泌3-吲哚乙酸 將38 株真菌接種到150 mL PDB 液體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)（250 mL 錐形瓶，30 ℃，120 r/min）8 d，用移液槍吸取200 μL 發(fā)酵液置白色坩堝內(nèi)。1∶1 加入標(biāo)準(zhǔn)比色液，在暗處靜置30 min后，觀察其顏色變化，同時以空白PDB 培養(yǎng)液為對照。以200 μL 3-吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)液（0.9 mg/L）加等量標(biāo)準(zhǔn)比色液作為陽性對照液，進行顏色比較。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)1 株內(nèi)生真菌LY-22 具有顯著陽性顏色反應(yīng)，并經(jīng)分子生物學(xué)手段鑒定為鐮刀屬真菌銳頂鐮刀菌Fusarium acuminatum。

2.2 銳頂鐮刀菌在4 種培養(yǎng)基的發(fā)酵液中分泌3-吲哚乙酸測定

2.2.1 樣品溶液制備 將銳頂鐮刀菌分別在PDB、SDB、MA、SNB 4 種培養(yǎng)基液體中培養(yǎng)14 d（120 r/min，30 ℃），每種培養(yǎng)基同一批次共發(fā)酵21 瓶。每隔2 d 取其中3 瓶，以抽濾法分離菌液和菌絲，以乙酸乙酯和菌液1∶1進行萃取，共萃取3 次。將乙酸乙酯萃取液合并，濃縮蒸干后，用色譜級甲醇定容至3 mL。

2.2.2 3-吲哚乙酸對照品溶液制備 用天平準(zhǔn)確稱取4.50 mg 3-吲哚乙酸對照品，以色譜甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，制備成0.090 mg/mL 的3-吲哚乙酸甲醇溶液。

2.2.3 色譜條件 Venusil ASB -C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相水-乙腈（65∶35）；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm。在此條件下，樣品中的3-吲哚乙酸與其他色譜峰能較好的分離，見圖1。

2.2.4 精密度試驗 取同一對照品溶液15 μL，在“2.2.3”項色譜條件下，重復(fù)進樣5 次，測得3-吲哚乙酸峰面積RSD 為0.80%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一對照品溶液15 μL，在“2.2.3”項色譜條件下，分別于0、1、3、5、7 h 進樣，測得3-吲哚乙酸峰面積RSD 為0.97%，表明溶液在7 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取相同條件下的PDB 發(fā)酵液3 份，按“2.2.1”項下方法制備樣品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下，進樣15 μL，測定3-吲哚乙酸的峰面積，按外標(biāo)法計算含有量，RSD 為1.30%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.7 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項下對照品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下，分別進樣2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15 μL 測得3-吲哚乙酸峰面積，以對照品體積為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，得方程為Y＝185 371X-29 488（r＝0.999 6），表明線性關(guān)系良好。

2.2.8 4 種液體培養(yǎng)基中3-吲哚乙酸測定 銳頂鐮刀菌在4 種液體培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)期間每隔2 d 測其發(fā)酵液中的3-吲哚乙酸含有量，測定結(jié)果表明在第10 天左右生長激素分泌量達到最高值并基本保持平穩(wěn)，且在PDB 液體發(fā)酵液中產(chǎn)出量最高（經(jīng)HPLC 測定，該真菌在PDB 液體發(fā)酵液中分泌3-吲哚乙酸的量約為1.80 mg/L），SDB 液體發(fā)酵液中含有量次之，但未在SNB 發(fā)酵液中檢測到3-吲哚乙酸的存在，見圖2。

3 結(jié)論與討論

本研究從懷山藥中分離得到的38 株內(nèi)生真菌中經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)1 株內(nèi)生真菌銳頂鐮刀菌具有顯著分泌生長激素3-吲哚乙酸的能力。利用PDB、SDB、SNB、MB 4 種不同培養(yǎng)基對銳頂鐮刀菌進行液體培養(yǎng)，測定該真菌分泌3-吲哚乙酸的能力，結(jié)果表明銳頂鐮刀菌在PDB 培養(yǎng)基中發(fā)酵10 d左右，菌液中的 3-吲哚乙酸產(chǎn)量達到最高值，約為1.80 mg/L。

近年來在很多植物中，內(nèi)生真菌對宿主有促生作用的報道。張春英等［11］研究發(fā)現(xiàn)盆栽杜鵑根部接種樹粉孢屬真菌菌株，對盆栽杜鵑花的生長具有明顯的促進作用。陳志為等［12］將臺灣相思樹的不同優(yōu)勢內(nèi)生真菌組合澆根回接于幼苗，發(fā)現(xiàn)對幼苗所測各項生理指標(biāo)均顯示促進作用。懷山藥作為河南的道地藥材之一，具有悠久的栽培歷史，藥材產(chǎn)地具有明顯的地域性，但至今鮮有報道內(nèi)生真菌對其具有促生作用。3-吲哚乙酸最明顯的生態(tài)作用是促進植物生長，但對植物莖、芽、根不同部位生長的促進作用因濃度而異。在細(xì)胞水平上，3-吲哚乙酸可刺激形成植物層細(xì)胞分裂；刺激枝的細(xì)胞伸長、抑制根細(xì)胞生長；促進木質(zhì)部、韌皮部細(xì)胞分化，促進插條發(fā)根、調(diào)節(jié)愈傷組織的形態(tài)建成；在器官和整株水平上，3-吲哚乙酸從幼苗到果實成熟都起作用［13-14］。本實驗在懷山藥中首次篩選得到具有產(chǎn)3-吲哚乙酸能力的內(nèi)生真菌銳頂鐮刀菌，但該內(nèi)生真菌是否對懷山藥植株的生長具有促進作用仍需要將菌種回接試驗來驗證，其具體的促生機制值得進一步深入研究。后續(xù)實驗結(jié)果若表明3-吲哚乙酸對懷山藥大田栽培的確發(fā)揮了明顯的促生長作用，將來可開發(fā)成生物生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于懷山藥的生產(chǎn)實踐。