沈圓兵 方煥

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 安徽 蚌埠 233000）

肺癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢，研究肺癌相關(guān)基因?qū)τ陉U明肺癌發(fā)生、發(fā)展的機理以及診斷和治療都有重要意義。Notch1信號通路的異常活化有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，具有腫瘤表達的特異性，乳腺癌中有研究發(fā)現(xiàn)survivin可能是notch1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的直接靶基因[1]，而在肺癌中有關(guān)Notchl和survivin表達的相關(guān)性研究國內(nèi)、外鮮有報道。本研究采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測A549中Notchl和survivin的共表達，并用γ-分泌酶抑制劑DAPT-抑制Notch信號通路作用于A549細胞48h后激光共聚焦檢測兩者的熒光強度，探討兩者在非小細胞肺癌中發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，為進一步探明肺癌的發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)和實驗數(shù)據(jù)。

1.資料與方法

1.1 標(biāo)本及試劑

人肺腺癌A549細胞購自中國上海生命科學(xué)院，按常規(guī)方法培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的A549細胞，用F-12 HAMS培養(yǎng)基制備成1×104/ml細胞懸液，接種于放置有潔凈無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中。細胞貼壁后加入40umol/L DAPT處理，48h后取出蓋玻片，以PBS液洗滌3次，4%多聚甲醛固定15min，自然風(fēng)干后備用。γ-分泌酶抑制劑購自sigma公司，鼠抗人notch1單克隆抗體購自SantaCruz公司，兔抗人survivin多克隆抗體、DyLightTM488標(biāo)記山羊抗鼠IgG以及DyLightTM 594標(biāo)記羊抗兔IgG均購自北京中山生物技術(shù)公司。

1.2 細胞雙標(biāo)免疫熒光染色

雙標(biāo)免疫熒光檢測參照Bemardini等[1]介紹的方法進行，具體實驗過程中的時間、濃度和溫度自行摸索，簡要步驟如下：4%多聚甲醛固定15min，PBS液漂洗3次×5min，0.5%Triton穿孔20min，PBS液漂洗3次×5min，1%BSA（牛血清白蛋白）封閉30min，傾去，勿洗。將1%BSA稀釋的survivin兔抗人多克隆抗體(1∶60)和1%BSA稀釋的notch1鼠抗人單克隆抗體按體積比1∶1混勻，一起加到切片上，4℃孵育過夜；PBS充分漂洗后加DyLightTM 488標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶30)以及DyLightTM 594(1∶40)標(biāo)記羊抗兔IgG按體積比1∶1混勻，避光操作將其滴加到切片上，37℃孵育箱避光孵育1h；PBS漂洗3次×5min，用甘油封片后，熒光顯微鏡下預(yù)觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 激光共聚焦顯微鏡觀察

利用D-EcliPse-C1型激光共聚焦顯微鏡觀察并攝像，DyLightTM488的激發(fā)波長為488nm，DyLightTM 594的激發(fā)波長為595nm。notch1陽性表達熒光呈綠色；Survivin陽性表達熒光呈紅色；兩者共表達則表現(xiàn)為黃色熒光。為定量分析γ-分泌酶抑制劑處理前后兩者的熒光強度，選擇細胞較為密集的區(qū)域，每張切片選取熒光表達最強的10個視野掃描觀察并由計算機自帶掃描分析軟件測定熒光強度與面積。熒光值=平均熒光強度x平均熒光面積。該部分實驗重復(fù)3次，以平均熒光強度作為該蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

Notch1在A549細胞中陽性表達呈綠色熒光；survivin陽性表達呈紅色熒光；兩者在同一位置共表達呈黃色熒光。γ-分泌酶抑制劑處理前后兩者的表達見圖1和圖2。統(tǒng)計學(xué)分析顯示γ-分泌酶抑制劑處理后兩者的表達較處理前明顯減少，P＜0.05，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表。

圖1 γ-分泌酶抑制劑處理前notch1和survivin在A549細胞中的表達

圖2 γ-分泌酶抑制劑處理48h后notch1和survivin在A549細胞中的表達

表 γ-分泌酶抑制劑處理前后notch1和survivin在A549細胞中的表達

3.討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類生命健康常見的惡性腫瘤，全球肺癌的發(fā)病率和死亡率均居各癌癥之首，雖然診斷和治療水平均有所提高，但肺癌的預(yù)后仍然很差，目前總體5年生存率只有16%左右[2]，這與肺癌的發(fā)病機制至今未明有關(guān)。許多研究表明notch1和肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，γ-分泌酶是notch信號調(diào)控的主要介質(zhì)，DAPT是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，可以特異性阻斷Notch信號通路，可抑制notch活性和阻止notch胞內(nèi)段活性部分NICD的產(chǎn)生，已被證明在抗腫瘤方面具有潛在作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)活化的Notch1可上調(diào)腫瘤細胞BcL-2和抑制P53的表達而發(fā)揮抗凋亡作用[4]，而作為抗凋亡蛋白家族重要成員的survivin于前期研究中發(fā)現(xiàn)在肺癌中異常高表達，且Lee等[1]研究發(fā)現(xiàn)notch1在乳腺癌中高表達，在MDA-MB-231細胞中notch1活化導(dǎo)致survivin表達增加，notch1基因沉默導(dǎo)致survivin表達下降，且survivin可能是notch1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的直接靶基因，控制有絲分裂和凋亡耐受，而在肺癌中notch1和survivin的相關(guān)性研究報道較少，探討notch1和survivin在肺癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)性研究對揭示肺癌的發(fā)病機制和靶向治療有著不可估量的前景；本研究通過免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦觀察和分析notch1和survivin在A549細胞中表達的相關(guān)性，并用γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制notch1的表達，48h后用掃描分析軟件測定熒光強度與面積，根據(jù)公式計算出熒光強度值，以平均熒光強度作為該蛋白的相對表達量，分析survivin的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)notch1和survivin在A549細胞質(zhì)和細胞核同一位置存在共表達，且DAPT處理48h后兩者的表達均顯著降低（P＜0.01），表明notch1和survivin在NSCLC A549細胞中存在共表達；Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中存在notch1-survivin信號軸，表明survivin可能是notch1的下游靶基因，前期研究發(fā)現(xiàn)HIF-1a參與survivin的表達調(diào)控，基因沉默后survivin的表達降低，同時共同參與肺癌裸鼠移植瘤的生長[5]，是否在NSCLC中也存在這一信號軸、HIF-1a是否參與此信號研究是今后我們研究的重點，以此進一步闡明肺癌的發(fā)病機制，為肺癌的臨床治療提供更多的實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。