楊明，許晴，李首道，田甜，涂鳳琴*，酈娟

武漢食品化妝品檢驗所（武漢 430012）

柑橘紅2號（Citrus red No.2）是一種橘紅色人造染料，具有潛在的致癌性[1]。世界范圍內(nèi)，除了美國和加拿大允許在一些特定條件下使用柑橘紅2號染料[2]，且規(guī)定全果中柑橘紅2號染料最大殘留量不得超過2 mg/kg，其他國家都禁止使用[3]。但在利益驅(qū)使下，一些不法商販違規(guī)將其用于柑橘類水果增色以吸引消費者眼球，提高市場競爭力，給消費者造成較大健康風(fēng)險。因此，建立高效、快速、靈敏的分析方法加強柑橘類水果中柑橘紅2號染料的監(jiān)測，對于保障人民群眾的食品安全具有重要意義。

柑橘紅2號染料的檢測方法主要有表面增強拉曼光譜法（SERS）[4]、高效液相色譜法（HPLC）[3,5-9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[10-12]等。其中，高效液相色譜法應(yīng)用較為廣泛，但其檢測靈敏度較低，定性能力較弱，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以其高選擇性、高靈敏度和優(yōu)異的定性定量能力等特性，能夠很大程度上提高方法靈敏度和測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。在前處理技術(shù)方面，已報道的分析方法中大多采用乙腈、石油醚或正己烷-丙酮提取樣品中的柑橘紅2號染料后，經(jīng)NH2固相萃取小柱或中性氧化鋁小柱凈化，前處理步驟較為繁瑣，提取液通常需先經(jīng)濃縮與復(fù)溶，再進行凈化處理，檢測周期較長。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）技術(shù)是Anastassiades等[13]提出的一種快速、簡便、廉價、高效、耐用且安全的前處理技術(shù)，具有操作簡便、成本低、基質(zhì)適用范圍廣等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測、獸藥殘留檢測和真菌毒素分析等領(lǐng)域[14-19]。采用QuEChERS前處理技術(shù)的有關(guān)柑橘紅2號染料檢測方法少見報道。試驗采用QuEChERS樣品處理技術(shù)結(jié)合HPLC-MS/MS，建立柑橘類水果中柑橘紅2號染料的分析方法。該方法簡單、快速，靈敏度高，準(zhǔn)確性好。與文獻方法[10-11]比較，由于使用QuEChERS技術(shù)，方法的試劑用量相對更少，成本低，操作簡便快速。前處理過程中，提取液無需濃縮，簡化操作步驟，提高檢測效率，能滿足實際樣品的快速測定要求。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent 6460三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；Allegra X-15R Centrifuge離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；PM5-2000TL超聲波清洗器（普律瑪儀器公司）。

1.2 試劑與材料

甲醇、乙腈、乙酸銨（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；柑橘紅2號標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%，F(xiàn)irst Standard）；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（Graphitized carbon black，GCB）和N-丙基乙二胺（Primary secondary amine，PSA）吸附劑（天津博納艾杰爾科技有限公司）；無水硫酸鎂和氯化鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；去離子水（18.2 MΩ·cm，由Milli-Q純水儀制得）；0.1%甲酸溶液（準(zhǔn)確量取1 mL甲酸，用純水定容至1 000 mL）；10 mmol/L乙酸銨溶液（稱取0.77 g乙酸銨，用純水溶解并定容至1 000 mL）。

1.3 色譜條件

Waters Xbridge C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流速0.3 mL/min；流動相A含0.1% HCOOH的10 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B乙腈。梯度洗脫程序：0～3.0 min，20%～90%B；3.0～7.0 min，90% B；7.0～7.1 min，90%～20% B；7.1～9.0 min，90% B。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源，AJS ESI源；掃描模式，正離子掃描；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）采集模式；毛細管電壓（IS）4 000 V；干燥氣流速5 L/min；干燥氣溫度250℃；霧化氣壓力45 psi；鞘氣溫度320 ℃；鞘氣流速11 L/min。

1.5 樣品處理

稱取2 g（精確至0.000 1 g）均質(zhì)樣品置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，振蕩提取30 min，加入2 g氯化鈉，劇烈振搖1 min，以4 500 r/min離心10 min，待凈化。移取1.5 mL待凈化上清液加入到含有150 mg MgSO4、50 mg C18、50 mg PSA和50 mg GCB的凈化管中，渦旋振蕩1 min，以4 500 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取適量的柑橘紅2號標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容，配制質(zhì)量濃度200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃保存；根據(jù)需要，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別準(zhǔn)確移取適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白樣品基質(zhì)提取液配制成質(zhì)量濃度為0.05，0.2，0.5，2.0，5.0和20 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

試驗選擇Waters Xbridge C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）進行分離分析，并考察柑橘紅2號在乙腈-水、乙腈-乙酸銨水、甲醇-水、甲醇-乙酸銨水等不同流動相組成中的色譜行為。結(jié)果表明柑橘紅2號在乙腈-乙酸銨水組成的流動相中響應(yīng)較高，因此選擇乙腈-乙酸銨水為色譜流動相，并比較不同濃度乙酸銨溶液對目標(biāo)物的影響情況。結(jié)果表明乙酸銨濃度10 mmol/L時，柑橘紅2號的響應(yīng)較好，峰形尖銳，因此選擇在水相中加入的乙酸銨濃度為10 mmol/L。在流動相中加入甲酸通?？梢蕴岣哒x子模式下物質(zhì)的離子化效率，進而增強其質(zhì)譜響應(yīng)。試驗表明，在10 mmol/L乙酸銨水溶液中加入0.1%甲酸（HCOOH）時，柑橘紅2號的響應(yīng)顯著提高，峰形對稱。因此選擇乙腈和含0.1% HCOOH的10 mmol/L乙酸銨水溶液為色譜流動相。

2.2 提取溶劑的選擇

試驗比較甲醇、乙腈、0.5%甲酸甲醇、0.5%甲酸乙腈等溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇提取的雜質(zhì)較多，相比之下乙腈的提取效率高，提取效果較好，因此選擇乙腈作為提取溶劑。樣品基質(zhì)中含有水，為促進水和乙腈分層，通常需加入鹽析試劑。試驗結(jié)果表明，加入2 g氯化鈉較為適宜，鹽析效果較好，可使水相與乙腈相具有良好分層效果。

2.3 吸附劑的選擇

C18、PSA和GCB是QuEChERS技術(shù)中常用的吸附劑。C18能除去脂類等非極性物質(zhì)；PSA能除去糖類、有機酸、脂肪酸、多酚等干擾物；GCB常用于吸附葉綠素、類胡蘿卜素等色素。試驗考察單一C18、PSA和GCB，以及三者的不同組合對柑橘紅2號回收率的影響。結(jié)果表明，C18、PSA和GCB三者組合使用凈化效果較好。無水硫酸鎂（MgSO4）常用于除去提取液中的水分，試驗選擇C18、PSA、GCB和MgSO4為吸附劑，并考察吸附劑的用量對樣品添加回收率的影響。MgSO4+C18+PSA+GCB為150 mg+50 mg+50 mg+50 mg時，凈化效果最佳，柑橘紅2號回收率高。因此，選擇150 mg MgSO4、50 mg C18、50 mg PSA和50 mg GCB的混合吸附劑。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

考察柑橘紅2號在不同電離模式下的質(zhì)譜響應(yīng)。結(jié)果表明，在電噴霧正離子掃描模式下，柑橘紅2號的響應(yīng)良好，靈敏度高。在一級質(zhì)譜掃描模式下，得到柑橘紅2號的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 309.0。根據(jù)二級質(zhì)譜掃描得到的二級碎片離子質(zhì)譜圖，選取響應(yīng)良好、干擾少的3對子離子m/z 278.0，m/z 153.1和m/z 138.1組成監(jiān)測離子對，m/z 309.0→153.1為定量離子對，m/z 309.0→278.0和m/z 309.0→138.1為定性離子對，并進一步優(yōu)化每個離子對的最佳碰撞能量（CE）。柑橘紅2號的母離子、子離子、碎裂電壓（Fragmentor）、碰撞能量（CE）等質(zhì)譜參數(shù)列于表1。圖1為柑橘紅2號標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）是指樣品分析時的共流出組分引起的分析信號增強或抑制現(xiàn)象[20]。基質(zhì)效應(yīng)通常以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來表示，比值0.85～1.15時，基質(zhì)效應(yīng)較弱；比值大于1.15時，存在較強的基質(zhì)增強效應(yīng)；比值小于0.85時，存在較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)。試驗采用溶劑和空白基質(zhì)提取液分別配制相同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過比較基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，實際樣品基質(zhì)對柑橘紅2號存在一定的離子化增強效應(yīng)，ME為1.07。因此，采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量，以補償基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量限

在優(yōu)化的前處理和測定條件下，對配制的系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，以柑橘紅2號的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)（y），相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，柑橘紅2號在0.05～20 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=3 508.1x+58.6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2。在此次試驗測定條件下，柑橘紅2號的檢出限（S/N≥3）為0.025 μg/kg，定量限（S/N≥10）為0.1 μg/kg。

2.7 回收率和精密度

分別在空白基質(zhì)樣品中添加4個不同濃度水平（0.25，1.0，5.0和50 μg/kg）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按該方法預(yù)處理，每個添加水平測定6次，計算回收率和精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）。柑橘紅2號的平均回收率為81.9%～94.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為2.6%～7.3%（表2）。結(jié)果表明，該方法回收率高、穩(wěn)定性好，適用于柑橘類水果中柑橘紅2號的測定。

表1 柑橘紅2號的母離子、子離子等重要質(zhì)譜參數(shù)

圖1 柑橘紅2號基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖

表2 柑橘紅2號的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.8 實際樣品測定

采用該方法對市售的20批次柑橘樣品進行測定。結(jié)果表明樣品中均未檢出柑橘紅2號。

3 結(jié)論

采用優(yōu)化的QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)，建立柑橘紅2號的快速分析方法，并用于實際樣品測定。方法前處理簡單快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能實現(xiàn)柑橘類水果中柑橘紅2號的快速、靈敏檢測，具有較高的實用價值和推廣價值。