候德莉，梁振綱*，陳文慧，王玉健，尹志兵

1. 海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心（?？?570311）；2. 海南大學(xué)材料與化工學(xué)院（?？?570228）

4-氯苯氧乙酸又稱防落素、促生靈、番茄靈等，是一種內(nèi)吸、廣譜、高效的酚類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，由植物的根、莖、葉、花、果吸收進(jìn)入植物體內(nèi)[1]，能防止作物落花落果、促進(jìn)果實(shí)發(fā)育、形成無(wú)籽果實(shí)、提早成熟、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)等[2-3]。隨著4-氯苯氧乙酸應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，其在人體內(nèi)的殘留和累積可能帶來(lái)健康隱患。已有研究表明，4-氯苯氧乙酸對(duì)小鼠的肝臟、腎臟以及成熟精細(xì)胞具有毒性作用[4-6]。因此，有必要建立準(zhǔn)確、快速、高效的4-氯苯氧乙酸殘留檢測(cè)方法。目前，檢測(cè)4-氯苯氧乙酸的方法有離子色譜法[7]、氣相色譜法[8-9]、氣質(zhì)聯(lián)用色譜法[10-11]、液相色譜法[12-14]以及液質(zhì)聯(lián)用色譜法[15-18]。液質(zhì)聯(lián)用色譜法靈敏度高、定性準(zhǔn)確，能夠有效排除雜質(zhì)干擾，是目前4-氯苯氧乙酸殘留分析的主要手段。但現(xiàn)有文獻(xiàn)前處理多為固相萃取[19-20]、液-液萃取[21-22]等，耗時(shí)長(zhǎng)且成本高。分散固相萃取技術(shù)利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用而達(dá)到除雜凈化的目的，具有快速、簡(jiǎn)便、低成本、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)。因此，試驗(yàn)采取分散固相萃取凈化，高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)，建立了以石墨化碳黑為分散萃取劑測(cè)定熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的檢測(cè)方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

乙腈、甲酸（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；石墨化碳黑凈化劑（美國(guó)Agilent公司）；微孔濾膜（0.22 μm，有機(jī)系）；4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%，購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：用乙腈配制成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200超高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；API 4000 Q四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)ABI公司）；配有電噴霧離子源；Harvard II針泵（美國(guó)Varian公司）；MS3 Basic旋渦混勻器（廣州IKA公司）；Centrifuge 5810 R離心機(jī)（Eppendorf公司）；G-285電子天平（Mettler公司）。

1.3 前處理方法

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）粉碎均質(zhì)后的水果樣品至50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，加入5 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋混合1 min，以4 000 r/min離心10 min，分取1 mL至玻璃試管中，加入100 mg GCB吸附劑，渦旋混合30 s后，以4 000 r/min離心3 min，取上清液，待測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore RP-MS（3 mm×150 mm，2.6 μm）。流速：0.6 mL/min。柱溫：40 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；離子源溫度600 ℃；離子源電壓5 500 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮?dú)?。?-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用流動(dòng)注射直接進(jìn)樣，通過(guò)全掃描確定化合物母離子，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子；通過(guò)優(yōu)化條件，得到二級(jí)質(zhì)譜圖。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖，推斷4-氯苯氧乙酸可能的斷裂方式，如圖1所示。

圖1 4-氯苯氧乙酸可能的斷裂方式

通過(guò)MRM選擇相對(duì)豐度較高的離子對(duì)，確定為定性定量離子對(duì)，并優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等參數(shù)。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 MRM模式下4-氯苯氧乙酸的掃描參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

4-氯苯氧乙酸為酚酸化合物，易溶于甲醇、乙腈、丙酮和苯。乙腈作為一種通用的提取溶劑，以其對(duì)蛋白質(zhì)、糖類和脂肪難提取，能有效消除基質(zhì)效應(yīng)影響的優(yōu)勢(shì)，在殘留檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[23-24]。由于4-氯苯氧乙酸為羧酸化合物，提取體系的pH會(huì)影響其在水相和乙腈相之間的分配平衡[25]，試驗(yàn)對(duì)比了乙腈和1%乙酸-乙腈兩種提取溶劑，結(jié)果表明，選用含有1%乙酸-乙腈作為提取溶劑，其平均回收率顯著提高。因此選擇1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

熱帶水果樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的糖分和有機(jī)酸類化合物，在未凈化處理時(shí)有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。試驗(yàn)比較了PSA、Florisil、中性氧化鋁（AL-N）、C18、C8和GCB等凈化方式。其中，加入PSA、Florisil和AL-N后回收率低，原因可能是PSA、Florisil對(duì)極性化合物有吸附作用，尤其是PSA對(duì)有機(jī)酸、酚類的吸附作用強(qiáng)，在凈化過(guò)程中同時(shí)吸附目標(biāo)化合物，而中性氧化鋁（AL-N）的表面是電中性的，容易保留芳香族等富電化合物，也是造成回收率低的原因之一；C18、C8在不同程度上對(duì)樣品中的色素有吸附作用，加入提取液后溶液明顯澄清，但是結(jié)果表明，加入后基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)沒(méi)有減弱，回收率偏高。GCB常用于蔬菜、水果、茶葉中農(nóng)藥殘留分析中的樣品凈化，能有效去除平面分子。試驗(yàn)表明，采用GCB作為凈化劑，回收率穩(wěn)定且符合殘留分析要求。不同凈化方式在添加水平為10.0 μg/kg時(shí)的回收情況見(jiàn)圖2。

圖2 不同凈化方式在添加水平為10.0 μg/kg時(shí)的回收率范圍

2.3 流動(dòng)相選擇

分別考察了甲酸-水體系、乙酸銨-水體系、甲酸-乙酸銨-水體系對(duì)峰形、響應(yīng)值等影響。結(jié)果表明，乙酸銨對(duì)待測(cè)組分有抑制作用，流動(dòng)相加入乙酸銨后，響應(yīng)值降低；使用甲醇-甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，色譜柱壓力較大，洗脫能力弱，響應(yīng)值僅為乙腈-甲酸水體系的50%。所以選用乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相。4-氯苯氧乙酸標(biāo)樣MRM色譜圖見(jiàn)圖3。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系及檢出限

基質(zhì)效應(yīng)是指在提取基質(zhì)中的目標(biāo)化合物時(shí)，樣品基質(zhì)中的某些共提取物組分影響目標(biāo)化合物的離子化，對(duì)待測(cè)物濃度或質(zhì)量的測(cè)定準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響，使得目標(biāo)化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強(qiáng)或者抑制的現(xiàn)象。試驗(yàn)采用相對(duì)響應(yīng)值法[26]考察4-氯苯氧乙酸在7種熱帶水果中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，進(jìn)行6平行測(cè)試，4-氯苯氧乙酸的基質(zhì)效應(yīng)值均在8%～100%之間，基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)。

配制質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5.0，10.0，25.0和50.0 ng/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依次進(jìn)樣，以目標(biāo)化合物的濃度X為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，4-氯苯氧乙酸在0.5～50.0 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。以實(shí)際檢測(cè)時(shí)的信噪比（RSN）為3作為檢出限，信噪比（RSN）為10作為定量限，該方法的檢出限（LOD）為0.3 μg/kg，定量限（LOQ）為1.0 μ g/kg。

圖3 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下4-氯苯氧乙酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

表3 4-氯苯氧乙酸的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.5 回收率與精密度試驗(yàn)

以荔枝、紅毛丹、番石榴、圣女果、菠蘿、木瓜、芒果樣品作為基質(zhì)，分別對(duì)其添加低、中、高三個(gè)水平的4-氯苯氧乙酸，每個(gè)添加濃度做6個(gè)平行試驗(yàn)，用于考察該方法的回收率和精密度，方法的平均回收率在81.0%～109.4%之間，RSD在2.7%～6.7%之間，結(jié)果見(jiàn)表4。7種基質(zhì)陰性樣品和標(biāo)準(zhǔn)添加樣品的MRM色譜圖見(jiàn)圖4。

表4 7種熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

圖4 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下7種熱帶水果陰性樣品和標(biāo)準(zhǔn)添加樣品色譜圖

3 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)近兩年海南省156批次出口水果樣品進(jìn)行檢測(cè)，2個(gè)鮮荔枝樣品、1個(gè)芒果樣品檢出4-氯苯氧乙酸，檢出值分別為33.0，16.0和6.28 μg/kg，檢出率為1.92%，其中一個(gè)荔枝樣品超出日本肯定列表的規(guī)定。

4 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)前處理方法中的提取溶劑、凈化條件、流動(dòng)相以及對(duì)儀器的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測(cè)方法。結(jié)果表明，在1.0，10.0和100.0 μg/kg三個(gè)添加水平下，回收率范圍為81.0%～109.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～6.7%，滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》要求。該方法快速簡(jiǎn)便，定量準(zhǔn)確，檢出限能達(dá)到0.3 μg/kg，能夠滿足日本肯定列表對(duì)熱帶水果中4-氯苯氧乙酸0.02 mg/kg的限量要求。