候德莉，梁振綱*，陳文慧，王玉健，尹志兵

1. 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心（?？?570311）；2. 海南大學材料與化工學院（海口 570228）

4-氯苯氧乙酸又稱防落素、促生靈、番茄靈等，是一種內(nèi)吸、廣譜、高效的酚類植物生長調(diào)節(jié)劑，由植物的根、莖、葉、花、果吸收進入植物體內(nèi)[1]，能防止作物落花落果、促進果實發(fā)育、形成無籽果實、提早成熟、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)等[2-3]。隨著4-氯苯氧乙酸應用范圍的不斷擴大，其在人體內(nèi)的殘留和累積可能帶來健康隱患。已有研究表明，4-氯苯氧乙酸對小鼠的肝臟、腎臟以及成熟精細胞具有毒性作用[4-6]。因此，有必要建立準確、快速、高效的4-氯苯氧乙酸殘留檢測方法。目前，檢測4-氯苯氧乙酸的方法有離子色譜法[7]、氣相色譜法[8-9]、氣質(zhì)聯(lián)用色譜法[10-11]、液相色譜法[12-14]以及液質(zhì)聯(lián)用色譜法[15-18]。液質(zhì)聯(lián)用色譜法靈敏度高、定性準確，能夠有效排除雜質(zhì)干擾，是目前4-氯苯氧乙酸殘留分析的主要手段。但現(xiàn)有文獻前處理多為固相萃取[19-20]、液-液萃取[21-22]等，耗時長且成本高。分散固相萃取技術利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用而達到除雜凈化的目的，具有快速、簡便、低成本、環(huán)境友好等優(yōu)勢。因此，試驗采取分散固相萃取凈化，高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜檢測，建立了以石墨化碳黑為分散萃取劑測定熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的檢測方法。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

乙腈、甲酸（色譜純，美國TEDIA公司）；石墨化碳黑凈化劑（美國Agilent公司）；微孔濾膜（0.22 μm，有機系）；4-氯苯氧乙酸標準品（純度≥99.0%，購自天津阿爾塔科技有限公司）。

標準溶液：用乙腈配制成1 000 μg/mL標準儲備液，于-20 ℃避光保存。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；API 4000 Q四極桿質(zhì)譜儀（美國ABI公司）；配有電噴霧離子源；Harvard II針泵（美國Varian公司）；MS3 Basic旋渦混勻器（廣州IKA公司）；Centrifuge 5810 R離心機（Eppendorf公司）；G-285電子天平（Mettler公司）。

1.3 前處理方法

準確稱取5 g（精確至0.01 g）粉碎均質(zhì)后的水果樣品至50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，加入5 g無水硫酸鈉，渦旋混合1 min，以4 000 r/min離心10 min，分取1 mL至玻璃試管中，加入100 mg GCB吸附劑，渦旋混合30 s后，以4 000 r/min離心3 min，取上清液，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore RP-MS（3 mm×150 mm，2.6 μm）。流速：0.6 mL/min。柱溫：40 ℃。進樣量：10 μL。流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負離子掃描；多反應監(jiān)測（MRM）模式；離子源溫度600 ℃；離子源電壓5 500 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣。將4-氯苯氧乙酸標準品溶液采用流動注射直接進樣，通過全掃描確定化合物母離子，再對母離子進行二級質(zhì)譜掃描，得到碎片離子；通過優(yōu)化條件，得到二級質(zhì)譜圖。根據(jù)二級質(zhì)譜圖，推斷4-氯苯氧乙酸可能的斷裂方式，如圖1所示。

圖1 4-氯苯氧乙酸可能的斷裂方式

通過MRM選擇相對豐度較高的離子對，確定為定性定量離子對，并優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等參數(shù)。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2。

表2 MRM模式下4-氯苯氧乙酸的掃描參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

4-氯苯氧乙酸為酚酸化合物，易溶于甲醇、乙腈、丙酮和苯。乙腈作為一種通用的提取溶劑，以其對蛋白質(zhì)、糖類和脂肪難提取，能有效消除基質(zhì)效應影響的優(yōu)勢，在殘留檢測中得到廣泛應用[23-24]。由于4-氯苯氧乙酸為羧酸化合物，提取體系的pH會影響其在水相和乙腈相之間的分配平衡[25]，試驗對比了乙腈和1%乙酸-乙腈兩種提取溶劑，結(jié)果表明，選用含有1%乙酸-乙腈作為提取溶劑，其平均回收率顯著提高。因此選擇1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

熱帶水果樣品基質(zhì)復雜，含有大量的糖分和有機酸類化合物，在未凈化處理時有基質(zhì)增強效應。試驗比較了PSA、Florisil、中性氧化鋁（AL-N）、C18、C8和GCB等凈化方式。其中，加入PSA、Florisil和AL-N后回收率低，原因可能是PSA、Florisil對極性化合物有吸附作用，尤其是PSA對有機酸、酚類的吸附作用強，在凈化過程中同時吸附目標化合物，而中性氧化鋁（AL-N）的表面是電中性的，容易保留芳香族等富電化合物，也是造成回收率低的原因之一；C18、C8在不同程度上對樣品中的色素有吸附作用，加入提取液后溶液明顯澄清，但是結(jié)果表明，加入后基質(zhì)增強效應沒有減弱，回收率偏高。GCB常用于蔬菜、水果、茶葉中農(nóng)藥殘留分析中的樣品凈化，能有效去除平面分子。試驗表明，采用GCB作為凈化劑，回收率穩(wěn)定且符合殘留分析要求。不同凈化方式在添加水平為10.0 μg/kg時的回收情況見圖2。

圖2 不同凈化方式在添加水平為10.0 μg/kg時的回收率范圍

2.3 流動相選擇

分別考察了甲酸-水體系、乙酸銨-水體系、甲酸-乙酸銨-水體系對峰形、響應值等影響。結(jié)果表明，乙酸銨對待測組分有抑制作用，流動相加入乙酸銨后，響應值降低；使用甲醇-甲酸水作為流動相時，色譜柱壓力較大，洗脫能力弱，響應值僅為乙腈-甲酸水體系的50%。所以選用乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。4-氯苯氧乙酸標樣MRM色譜圖見圖3。

2.4 基質(zhì)效應、線性關系及檢出限

基質(zhì)效應是指在提取基質(zhì)中的目標化合物時，樣品基質(zhì)中的某些共提取物組分影響目標化合物的離子化，對待測物濃度或質(zhì)量的測定準確度產(chǎn)生影響，使得目標化合物在儀器上的響應發(fā)生增強或者抑制的現(xiàn)象。試驗采用相對響應值法[26]考察4-氯苯氧乙酸在7種熱帶水果中的基質(zhì)效應。結(jié)果顯示，進行6平行測試，4-氯苯氧乙酸的基質(zhì)效應值均在8%～100%之間，基質(zhì)效應可忽略不計。

配制質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5.0，10.0，25.0和50.0 ng/mL一系列標準曲線，并依次進樣，以目標化合物的濃度X為橫坐標、相應的峰面積Y為縱坐標，作標準曲線。結(jié)果表明，4-氯苯氧乙酸在0.5～50.0 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關系，線性方程及相關系數(shù)見表3。以實際檢測時的信噪比（RSN）為3作為檢出限，信噪比（RSN）為10作為定量限，該方法的檢出限（LOD）為0.3 μg/kg，定量限（LOQ）為1.0 μ g/kg。

圖3 多反應監(jiān)測模式下4-氯苯氧乙酸的標準色譜圖

表3 4-氯苯氧乙酸的線性方程和相關系數(shù)

2.5 回收率與精密度試驗

以荔枝、紅毛丹、番石榴、圣女果、菠蘿、木瓜、芒果樣品作為基質(zhì)，分別對其添加低、中、高三個水平的4-氯苯氧乙酸，每個添加濃度做6個平行試驗，用于考察該方法的回收率和精密度，方法的平均回收率在81.0%～109.4%之間，RSD在2.7%～6.7%之間，結(jié)果見表4。7種基質(zhì)陰性樣品和標準添加樣品的MRM色譜圖見圖4。

表4 7種熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的平均回收率和相對標準偏差（n=6）

圖4 多反應監(jiān)測模式下7種熱帶水果陰性樣品和標準添加樣品色譜圖

3 實際樣品檢測

對近兩年海南省156批次出口水果樣品進行檢測，2個鮮荔枝樣品、1個芒果樣品檢出4-氯苯氧乙酸，檢出值分別為33.0，16.0和6.28 μg/kg，檢出率為1.92%，其中一個荔枝樣品超出日本肯定列表的規(guī)定。

4 結(jié)論

試驗通過對前處理方法中的提取溶劑、凈化條件、流動相以及對儀器的色譜和質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，建立了熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。結(jié)果表明，在1.0，10.0和100.0 μg/kg三個添加水平下，回收率范圍為81.0%～109.4%，相對標準偏差為2.7%～6.7%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求。該方法快速簡便，定量準確，檢出限能達到0.3 μg/kg，能夠滿足日本肯定列表對熱帶水果中4-氯苯氧乙酸0.02 mg/kg的限量要求。